人STIM1基因真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的:构建人STIM1基因真核表达载体,并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法:提取HL-7702细胞总RNA,RT-PCR扩增,经纯化回收后将片段克隆至pGM-T载体,酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并测序,最后用重组质粒转染HL-7702细胞,通过PCR-电泳和Western blot法检测STIM1基因的表达.结果:PCR扩增的片段长度为342bp,测序结果以及重组质粒pGM-T-STIM1的酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果均证明STIM1基因成功克隆到真核表达载体中.PCR-电泳和Western blot实验结果分别显示转染重组质粒后的HL-7702细胞在基因与蛋白水平表达STIM1均有所增强.结论:成功构建了人STIM1基因的真核表达载体pGM-T-STIM1,并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达,为研究STIM1蛋白在人肝细胞内Ca2+浓度调控方面及其对人肝细胞分泌功能的影响奠定了良好的实验基础.

人TRPC1基因真核表达载体的构建及肝细胞表达

目的构建人TRPCI基因真核表达载体，并观察其在人肝细胞株（HL-7702）中的表达。方法提取细胞总RNA，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）得到TRPCI基因的编码序列，经纯化回收后克隆入表达载体pGM．T中，酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，最后转染HL-7702细胞，通过电泳和噻唑蓝（MTT）比色法检测基因表达与细胞生长。结果扩增片段长度为455bp，重组质粒pGM—T．TRPCI经酶切鉴定条带位置正确，证明表达载体成功构建。电泳结果显示转染重组质粒后的HL-7702细胞表达TRPCI增强。MTT检测发现转染前后肝细胞生长未受到明显影响（t值分别为0．43、-0．40、-2．01、-1．60、-0．41和-0．72，P值均〉0．05）。结论成功构建人TRPCI基因的真核表达载体pGM—T—TRPCI，并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达。