蜘蛛牵引丝蛋白的特性及其分子工程

蜘蛛牵引丝是由蜘蛛主壶腹腺产生的一种具有高度重复结构的蛋白质纤维,它将高抗张强度和高弹性奇妙地结合于一体,是自然界强度最高的纤维.基因解析揭示出牵引丝至少存在两种高度重复的蛋白组分,每种蛋白的重复单元都显示出富丙氨酸区和富甘氨酸区交替的模块结构特征,采用分子工程技术不仅可以生产出具有天然牵引丝蛋白特性的重组蜘蛛丝蛋白,也可为研究牵引丝蛋白的模块结构与功能特性之间的关系开辟道路,文中结合我们的研究综述了牵引丝蛋白的模块结构及其分子工程的研究进展,并就其未来发展进行展望,

用免疫亲和层析法纯化萝卜PHGPx天然蛋白(英文)

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(RsPHGPx)是一个定位于线粒体的蛋白质.为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的RsPHGPx.用重组RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组RsPH G Px 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗RsPHGPx 的抗体.将纯化好的抗体偶联到一个N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱.经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案.按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质.免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗RsPH G Px 的抗血清特异识别.酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的PH G Px 活性.这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的RsPH G Px天然蛋白.这是首个关于定位于植物细胞器的PH G Px 蛋白纯化的报道.这一结果为准确测定RsPH G Px 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物PH G Px 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究.

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因结构及其调控序列分析(英文)

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)家族的重要一员,是目前已知能直接保护生物膜免受过氧化损伤的唯一酶类.此前的研究表明,萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(RsPHGPx)编码一个有生理功能的过氧化物酶,并且RsPHGPx基因的表达可能受发育和环境胁迫信号的复杂调控.要深入了解该基因的表达调控机制首先必须阐明RsPHGPx基因的结构及其上游调控序列.DNA印迹表明萝卜RsPHGPx基因以单拷贝的形式存在于基因组中.以基因组DNA为模板,通过常规PCR与染色体步行相结合的方法克隆到了一段3.3kb长的RsPHGPx基因组序列.分析发现,该基因由7个外显子和6个内含子组成,所有内含子的剪切位点均符合真核生物GT-AG规则.另外还发现该基因的上游基因是生物素合成酶基因;位于RsPHGPx基因上游的调控序列只有不足300bp.这些结构特征与拟南芥AtGPX3基因极其相似.顺式作用元件的数据库搜索发现RsPHGPx基因的上游调控序列含有多个响应激素(如E-Box和W-Box)、胁迫(如转录因子MYB和MYC的结合位点)和光(如BoxⅡ和Ⅰ-Box)信号的元件.RNA印迹分析表明RsPHGPx基因的表达受到脱落酸(ABA)和连续光照(在黄化苗中)处理的负调控,受到冷胁迫(4℃)的正调控,这暗示了预测的顺式作用元件的调控作用.然而,除草剂paraquat对该基因表达的正调控作用,暗示了某些与氧化胁迫相关的未知元件的存在.这些结果进一步印证了RsPHGPx基因的表达受发育和环境胁迫信号复杂调控的推测.这是迄今为止首个关于植物PHGPx基因结构和上游调控序列的系统报道,为今后全面认识植物PHGPx基因的表达调控机制奠定了必要基础.

水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶的表达、纯化及晶体生长条件初筛

将水稻PHGPx(OsPHGPx)的编码序列克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并转化为大肠杆菌进行表达.通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,制备了可用于晶体学研究的OsPHGPx,其纯度超过95%,具备明显的PHGPx活性.质谱显示OsPHGPx的精确分子量为19642.5553,与理论分子量基本一致.OsPHGPx在多个晶体生长条件下出现微晶.三维结构同源建模显示OsPHGPx的结构为硫氧还蛋白折叠形式.

水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶的热稳定性研究

谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶是唯一能够直接还原生物膜上脂类过氧化物的过氧化物酶。利用圆二色光谱(CD)、内源荧光光谱和差示扫描量热仪(DSC)研究了温度对谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶(OsPHGPx)活性及其构象变化的影响。在温度为20～27.5℃期间,随着温度的逐渐升高,OsPHGPx的活性逐渐上升,到27.5℃时达到最大值;在27.5～45℃时,随着温度逐渐升高,其活性迅速下降;当温度超过45℃时,其活性完全丧失。在20～40℃,CD光谱、内源荧光光谱和DSC均没有发生明显变化,暗示OsPHGPx的结构基本保持完整;在40～55℃,CD光谱显示该酶二级结构发生去折叠;内源荧光光谱的变化暗示该酶三级结构发生去折叠。其中在40～45℃,DSC显示该酶可能存在两个去折叠中间体。当温度超过55℃时,整个酶的构象不再发生变化,呈现去折叠状态。

两个水稻GDP-甘露糖-3′, 5′-异构酶基因特征及表达模式的研究

GDP-甘露糖-3',5'-异构酶(GME)可以催化GDP-甘露糖转化为左旋GDP-半乳糖,该反应对于高等植物体内抗坏血酸的合成是非常重要的.但目前在分子水平上还没有对GME基因进行研究的报道.通过逆转录PCR(RT-RCR)技术从水稻成熟叶片中克隆到两个GME基因的cDNA序列,并与其他植物物种中的GMEs进行比对,结果显示,GME基因在所有植物物种中高度保守,尽管进化树分析表明单子叶植物GMEs和双子叶植物GMEs在进化上相互独立.同时,分析这两个水稻GME基因的剪切模式揭示了二者也存在高度相似性.采用半定量RT-PCR技术对两个GME基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达模式进行研究表明,OsGME1基因在冷胁迫条件下表达水平上调,这和先前水稻冷胁迫蛋白质组学研究的结果是一致的.而OsGME2和OsGME1基因在用赤霉素处理条件下表达水平均下调,暗示赤霉素可能通过调节GME基因的表达来调控植物体内的抗坏血酸合成.

水稻金属硫蛋白基因家族成员对铅胁迫的应答及其在铅敏感酵母中的功能互补

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸(Cys)、具有金属结合能力的蛋白质.采用Northern杂交分析了水稻幼苗中重金属铅离子对10个水稻MT基因表达的影响.结果显示,在根中,除了OsMT-Ⅰ-3b不表达外,其他9个基因的表达均不同程度地受到Pb2+的影响,其中OsMT-Ⅰ-1a,OsMT-Ⅰ-1b,OsMT-Ⅰ-2c,OsMT-Ⅰ-4a,OsMT-Ⅰ-4b和OsMT-Ⅰ-4c的表达大幅度增加,OsMT-Ⅰ-2a和OsMT-Ⅰ-3a的表达有所增加,而OsMT-Ⅰ-2b的表达则受到了抑制.相比之下,地上部分Pb2+只对其中的6个基因的表达有一定的诱导效应,对OsMT-Ⅰ-1a,OsMT-Ⅰ-1b,OsMT-Ⅰ-4a及OsMT-Ⅰ-4b的表达没有明显作用.分别把这10个基因在Pb2+敏感的酵母突变体中异源表达,结果表明,表达OsMT-Ⅰ基因的酵母细胞都在一定程度上提高了对Pb2+的耐受性.上述结果揭示了Pb2+影响OsMT基因家族各成员在水稻幼苗中表达的特征,以及OsMT-Ⅰs可以增强酵母突变体铅耐受性的描述,同时也为进一步研究水稻MT基因家族应答Pb2+的分子机制奠定了基础.

棉花中一个类DREB1/CBF基因(GhDREB1L)的分子克隆及其功能分析

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界环境胁迫上起到非常重要的作用,而且对于利用基因工程技术来提高植物的抗逆性也非常有用.从棉花中分离出一个编码DREB1/CBF类蛋白(GhDREB1L)的cDNA,并对该蛋白质的序列特性、DNA结合特性及转录本的表达特征进行了分析.GhDREB1L含有一个保守的AP2/ERF结构域,其氨基酸序列与其他植物中DREB家族的DREB1/CBF组成员高度相似.采用Ni-NTA亲和层析技术,成功纯化了在BL21(DE3)菌株中表达的GhDREB1L蛋白的DNA结合区.凝胶滞留实验揭示,纯化的GhDREB1L融合蛋白能够特异性地与已经得到鉴定的DRE元件(核心区,ACCGAC)以及胚胎发育晚期丰富蛋白基因LEAD113启动子区中的类DRE元件(核心区,GCCGAC)结合.半定量RT-PCR显示GhDREB1L基因在棉花子叶中受到低温、干旱以及NaCl处理的诱导.这些结果暗示了棉花GhDREB1L转录因子可能是通过与DRE元件的结合,在低温、干旱及高盐的应答途径中起重要作用.