人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测

为了获取神经营养素 -3 (NT-3 )将之用于神经系统疾病的治疗 ,采用 RT-PCR技术 ,从人胎脑组织特异性扩增并克隆了人 NT-3全长以及成熟蛋白编码基因 ,将其分别克隆至表达载体 pc DNA3 .1与 p ET2 8a,构建了重组真核表达载体 pc DNA3 .1-NT3和重组原核表达载体 p ET2 8-NT3 s。 pc DNA3 .1-NT3经脂质体介导转染至大鼠胚胎脑纹状体神经胶质细胞 ,以 G418筛选出抗性阳性克隆 ,该克隆株与大鼠胚脑纹状体神经干细胞体外共培养 5 d,MAP-2 (微管相关蛋白 2 )免疫细胞化学反应结果显示 ,转染细胞株所表达的 NT-3蛋白具有生物学活性 ,可促进共培养的纹状体神经干细胞的突起生长。将 p ET2 8-NT3 s转化大肠杆菌 ,以 IPTG诱导 ,获得了相对分子质量约 18k D的 6XHis-NT3融合蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %左右。经镍柱亲和纯化 ,得到纯度达 95 %的 rh NT-3蛋白 。

Wistar大鼠SONIC HEDGEHOG基因的克隆和表达

为了获得SHH蛋白以研究它在治疗神经变性疾病中的作用 ,本室提取不同胚龄Wistar胎鼠中的总RNA ,应用RT PCR技术获得SHH N的cDNA ,重组于pGEM T载体 ,经测序鉴定后 ,构建原核表达质粒并获得表达菌株Q15 SHH N ,然后诱导SHH蛋白的表达。结果发现 ,在E11.5 E2 0 .5胎鼠的脊索中能克隆到 6 30bp的cDNA片段 ,并且随胚龄增加 ,此片段的表达量逐渐减少 ;测序结果显示 ,此片段及其所编码的氨基酸序列同数据库中人、小鼠和SD大鼠的SHH N的序列有较高同源性 ;表达菌株经诱导后产生约 2 1kD的融合蛋白。提示SHH N是一种发育相关基因 ,在不同种属中的同源性较高 。

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .

核受体相关因子1的研究进展

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,主要表达于中脑黑质与腹侧被盖区 ,作为基因转录调控蛋白而参与了中脑多巴胺能神经元的发育与存活、长时记忆、肝再生及炎症等多种生理和病理过程。本文总结和讨论了有关Nurr1的编码基因、分子结构。

分泌性BACE1蛋白在昆虫细胞的表达

为了获得有活性的重组β-secretase并研究其功能,寻找特异性抑制剂,应用RT-PCR技术,从人胚胎脑组织特异性扩增并克隆了人BACE1编码基因的胞外片断(BACE1-454)。测序后与质粒pFastBac连接,得到含BACE1-454基因的重组质粒pFast-BACE1-454。将其转化到含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对重组穿梭载体Bacmid-BACE1-454进行鉴定。将Bacmid-BACE1-454经脂质体介导转染Sf9细胞,收获病毒。用重组杆状病毒颗粒感染昆虫细胞,表达蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性。

人BDNF的克隆、表达及其活性检测

为了研究脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Parkinson病中的作用,采用RT-PCR技术,从人胚脑组织扩增及克隆了BDNF全长及其成熟蛋白编码基因,经测序证实后,将其分别克隆至表达载体pcDNA3.1与pGEX6p-1,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-BDNF和重组原核表达载体pGEX6p-BDNFs。pcDNA3.1-BDNF经脂质体介导转染至体外培养的E16胚鼠中脑星形胶质细胞,以G418筛选出抗性阳性克隆,该克隆株与E12-E14胚鼠中脑神经干细胞体外共培养,酪氨酸羟化酶免疫细胞化学反应显示,转染细胞株所表达的BDNF蛋白具有生物学活性,可延长前体细胞的存活并促进其向多巴肢神经元分化。将pGEX6p-BDNFs转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得了相对分子质量约为40 kD的GST-BDNF融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的10％,并经免疫印迹证实具有特异的免疫反应性。