慢性低氧性肺动脉高压大鼠肺组织内质网应激介导的凋亡的变化

目的:探讨内质网应激介导的凋亡在低氧性肺动脉高压大鼠肺组织中的变化及意义。方法:清洁级雄性SD大鼠22只随机被均分成对照组和低氧组(n=11)。采用常压低氧法复制慢性低氧高二氧化碳性肺动脉高压模型,4周后,测定肺动脉平均压(mPAP)、右心室游离壁(RV)和左心室加室间隔(LV+S)重量比、肺细小动脉管壁面积/管总面积(WA/TA)、管腔面积/管总面积(CA/TA)及肺细小动脉中膜厚度(PAMT)作为模型指标。Hoechst染色检测肺组织凋亡细胞核。RT-PCR检测肺组织中胱冬酶12(caspase12)和葡萄糖调节蛋白78与94(GRP78、GRP94)mR-NA的表达水平。免疫组化法检测肺组织GRP78、GRP94蛋白的表达。结果:①与对照组相比,低氧组mPAP高50.5%,RV/(LV+S)高37.3%,WA/TA高72.5%,PAMT高137%,而CA/TA低41.9%(均P<0.01)。②Hoechst染色结果显示低氧组肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞可见较多呈高蓝光细胞核,肺血管中膜平滑肌细胞见低蓝光细胞核。③半定量RT-PCR结果显示,与对照组相比,低氧组肺组织caspase12 mRNA高144%,GRP78 mRNA高137%,GRP94 mRNA高80.7%(均P<0.05)。④免疫组化半定量结果显示,低氧组GRP78、GRP94蛋白明显高于对照组(均P<0.01),棕黄色颗粒表达主要位于肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞,而中层平滑肌层表达不明显。结论:内质网应激介导的凋亡与大鼠慢性低氧性肺动脉高压、肺血管改建的病理过程有关。

低氧对顺铂损伤A549细胞的影响

目的探讨低氧条件对顺铂损伤人非小细胞肺癌A549细胞的影响。方法实验分为两大组:常氧组(正常对照组、顺铂10μmol/L组、顺铂20μmol/L组);1%低氧组(正常对照组、顺铂10μmol/L组、顺铂20μmol/L组)。应用MTT法检测顺铂在常氧和低氧条件下对A549细胞增殖率的影响;MDC染色检测细胞自噬空泡的变化;Hoechst33342染色检测细胞核变化。结果与对照组相比,顺铂能降低A549细胞增殖率,并呈剂量依赖性,细胞自噬空泡无明显积聚,但细胞核发生显著皱缩;低氧条件下细胞内出现大量自噬空泡积聚,且低氧明显降低了顺铂对A549细胞增殖率的影响,降低了顺铂对细胞的损伤作用。结论顺铂能够诱导A549细胞损伤,而低氧条件引起了细胞自噬过程,并降低了顺铂的损伤作用。推测低氧时的细胞自噬在顺铂损伤A549细胞过程中可能是一种保护作用。

低氧性肾间质纤维化和游泳运动对大鼠尾加压素Ⅱ及其受体表达的影响

目的:探讨慢性低氧性肾纤维化大鼠尾加压素Ⅱ(UⅡ)及其受体(GPR14)的变化,以及游泳运动在其中的作用。方法:45只雄性SD大鼠随机分成3组,即对照组、低氧组(低氧7周)和游泳组(低氧+游泳锻炼7周组,即低氧3周后,每天1 h无负重游泳4周)。测定血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)和血桨UⅡ含量,以及肾组织羟脯氨酸(Hyp)含量、UⅡ及GPR14 mRNA表达和UⅡ蛋白表达。结果:(1)Scr和BUN含量:低氧组较对照组分别低18.5%和14.1%(均P<0.05),而游泳组与低氧组间无显著差别;(2)肾组织Hyp含量:低氧组较对照组高42.9%(P<0.01),而游泳组较低氧组低26.1%(均P<0.05);(3)血浆UⅡ含量:低氧组较对照组高380.8%(P<0.01),而游泳组较低氧组低42.6%(P<0.01);(4)肾组织UⅡmRNA表达:低氧组较对照组上调104.5%,游泳组较低氧组下调33.2%(均P<0.01);GPR14 mRNA表达:低氧组较对照组上调35.4%(P<0.01),而游泳组与低氧组间无显著差异;(5)肾组织UII蛋白的表达:低氧组明显高于对照组(P<0.01),而游泳组低于低氧组(P<0.01);(6)van Gieson染色显示低氧组肾血管胶原纤维增生明显,而游泳组明显改善。结论:慢性低氧性肾纤维化大鼠尾加压素Ⅱ及其受体的表达上调;适度游泳运动有减轻慢性低氧肾间质纤维化的作用,并下调尾加压素Ⅱ基因与蛋白的表达。

游泳运动对低氧性肺动脉高压大鼠肺组织apelin及其受体表达的影响

目的:探讨游泳运动对大鼠肺组织新的小分子活性肽apelin及其受体(APJ)表达的影响。方法:45只雄性大鼠随机分成三组:正常对照组、低氧组(七周)和游泳组(低氧+游泳锻炼七周组,低氧3周后,于每天入低氧舱前行无负重游泳运动60 min,每天1次)。七周后测定各组大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室与左心室加室间隔的重量比[RV/(LV+S)]、肺细小动脉管壁面积/管总面积(WA/TA)、管腔面积/管总面积(CA/TA)及中膜厚度(PAMT)。免疫蛋白印迹与免疫组化法测定肺组织apelin/APJ的蛋白表达。结果:①低氧组mPAP和RV/(LV+S)比正常对照组分别高73.6%和31.2%(P均<0.01),而游泳组比低氧组分别低21.1%和8.9%(P均<0.05)。②低氧组WA/TA和PAMT较正常对照组分别高70.8%和102%,而游泳组较低氧组分别低24.8%和40.1%(P均<0.01)。低氧组CA/TA较正常对照组低15.1%,而游泳组较低氧组高10.3%(P均<0.01)。③低氧组肺组织apelin蛋白表达较正常对照组上调374%(P<0.01),而APJ蛋白表达下调87.1%(P均<0.01);游泳组肺组织apelin蛋白表达较低氧组下调48%,而APJ蛋白表达上调287%(P均<0.01)。④apelin蛋白主要在血管外膜及炎症细胞胞浆内表达,APJ蛋白主要在血管内膜、外膜及炎症细胞上表达。结论:游泳运动减缓肺动脉高压和肺血管重塑作用可能与调节肺组织apelin/APJ系统的表达有关。

Apelin对大鼠离体肺动脉环的舒张作用及与一氧化氮的关系

目的：探讨新的小分子活性肽Apelin对大鼠离体肺动脉环的舒张作用及与一氧化氮（NO）途径的关系,并比较低氧大鼠的肺动脉环对Apelin的舒张反应与正常大鼠的差异。方法：36只大鼠随机分为正常组与低氧组;采用离体血管环灌流法,检测Apelin对去甲肾上腺素（NE）预收缩的大鼠离体肺主动脉环的舒张效应,观察去内皮或用一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）、可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）抑制剂（ODQ）孵育后该舒张率的变化。结果：①在正常组大鼠肺动脉环,Apelin（0.01~100 nmol/L）具有浓度依赖性的舒张效应。去除内皮后,Apelin对NE预先收缩的肺血管舒张效应明显减弱（P〈0.01）。L-NAME或ODQ预孵育后,Apelin的舒张效应均明显减弱（P均〈0.01）。②低氧组大鼠的肺动脉环对Apelin的舒张反应明显低于正常组大鼠,在最大浓度100 nmol/L时,Apelin的效应低60.45%（P〈0.01）,而两组EC50相比差异无显著性（P〉0.05）。结论：Apelin具有内皮依赖性的舒张肺动脉环的作用,该效应与NO-sGC-cGMP信号途径有关;低氧大鼠的离体肺动脉环对Apelin的舒张反应减弱。

野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织apelin及其受体的变化

目的:探讨新的小分子活性肽apelin及其受体(APJ)在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中的变化及意义。方法:雄性SD大鼠25只,随机分为对照组(n=10)和野百合碱组(n=15)。野百合碱组大鼠一次性腹部注射野百合碱60 mg/kg,对照组注射相同剂量的溶媒。注射野百合碱后第21天时,测定大鼠平均肺动脉压,HE染色观察肺组织病理学变化,Masson三色染色检测肺血管重建指标,放射免疫法及Western blot法测定肺组织中apelin和APJ的蛋白,RT-PCR法观察肺组织apelin和APJ的基因。结果:野百合碱组的平均肺动脉压、右心室肥大指数、肺血管重建指标、肺组织中apelin蛋白含量均明显高于对照组,而肺组织中APJ蛋白及基因表达显著低于对照组(P<0.05,P<0.01);但肺组织apelin基因表达两组间无显著统计学差别。免疫组化定位发现,野百合碱组大鼠apelin及APJ蛋白在肺组织内的炎症细胞胞膜及胞浆内呈强阳性表达。结论:内源性apelin及其受体的表达异常可能在野百合碱诱发的肺动脉高压的发生发展中起重要作用。

Apelin及其受体和一氧化氮合酶在氧诱导的新生小鼠增生性视网膜病变中表达上调

目的:通过观察apelin及其受体APJ和一氧化氮合酶(NOS)在氧诱导的新生小鼠增生性视网膜病变中的表达,探讨apelin/APJ和一氧化氮(NO)是否参与了早产儿视网膜病变新生血管的发生。方法:36只7日龄C57BL/6J新生小鼠随机均分为高氧组和对照组。高氧组暴露在75%±2%的氧浓度下5 d后,在正常空气环境下饲养5 d;对照组小鼠在正常氧环境下饲养10 d。两组均在17日龄处死,取左眼眼球做石蜡切片,HE染色计数突破内界膜的血管内皮细胞核数,以判断造模是否成功。实时荧光定量PCR检测右眼视网膜组织apelin和APJmRNA的表达,免疫荧光组织化学法检测视网膜apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白的表达。结果:高氧组视网膜平均每个切面突破内界膜的血管内皮细胞核数(35.13±10.13)明显高于对照组(0.30±0.21,P<0.01),说明造模成功。高氧组apelin和APJ mRNA水平显著高于对照组,分别为对照组的32.2倍和17.6倍(均P<0.01)。组织免疫荧光结果显示高氧组apelin和APJ蛋白表达明显强于对照组,并且主要强表达于新生血管周围;高氧组eNOS和iNOS蛋白表达明显强于对照组,但主要强表达于新生血管下方视网膜组织,在突破内界膜的血管内皮细胞核周围未见表达明显增强。结论:Apelin/APJ及NOS可能与氧诱导的新生小鼠增生性视网膜病变新生血管的发生有关。

急性肺损伤大鼠血浆及支气管肺泡灌洗液中apelin含量的变化

目的:观察急性肺损伤大鼠血浆及支气管肺泡灌洗液(BALF)中apelin含量的变化,探讨apelin在急性肺损伤(ALI)中的意义。方法:雄性Wistar大鼠18只,随机分为对照组(n=8)和油酸模型组(n=10),油酸组尾静脉一次性注入油酸0.2ml/kg,对照组尾静脉内注射生理盐水0.2ml/kg。检测BALF中蛋白含量及中性粒细胞比例,放免法检测血浆及BALF中apelin-36含量。结果:①油酸组BALF中细胞计数、蛋白含量及中性粒细胞占细胞总数的百分比均显著高于对照组(P均<0.01);②油酸组血浆及BALF中apelin-36含量较对照组显著升高(P均<0.01)。结论:ALI时大鼠血浆及BALF中apelin-36含量升高。

实时观察Rho激酶对离体培养施万细胞形态和迁移的作用

目的探讨Rho激酶(ROCK)对离体培养大鼠施万细胞形态和迁移的作用。方法运用原代培养施万细胞技术,并采用细胞免疫荧光化学技术鉴定施万细胞的纯度,同时建立实时观察施万细胞形态和迁移的单细胞迁移平台。基于该平台,在迁移施万细胞前方给予ROCK抑制剂Y-27632浓度梯度,显微实时观察该抑制剂对施万细胞形态和迁移的作用。结果 1.细胞免疫荧光化学显示原代培养的细胞为高纯度的施万细胞;2.单细胞迁移平台非常适合实时研究施万细胞形态和迁移;3.在迁移施万细胞前方给予ROCK抑制剂Y-27632浓度梯度能明显地促进施万细胞突起分支增多,突起变细长,并抑制施万细胞迁移。结论 ROCK能维持施万细胞形态,并调节施万细胞运动、迁移能力。

血管平滑肌细胞在不同细胞外基质的迁移特性:玻片倒扣法研究

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)迁移参与血管发育和多种疾病的发生、发展过程,然而其迁移机制尚不清楚。本课题建立了一种适合研究VSMCs迁移的方法——玻片倒扣法,基于该方法进一步研究VSMCs在不同细胞外基质上的迁移特性及机制。原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs),采用免疫细胞化学方法鉴定其纯度。将细胞接种于小玻片上,待生长至单层汇合后,将小玻片倒扣于包被有不同细胞外基质的大玻片上,培养24h后,固定、拍照、统计软件测量迁移出的细胞数量和迁移距离。进一步采用细胞划痕实验和免疫细胞化学技术,研究细胞外基质对PASMCs迁移的作用及机制。结果显示:(1)原代培养PASMCs纯度高达(97±3)%;(2)玻片倒扣24h后,层粘连蛋白(laminin)组、基质胶(Matrigel)组比对照(phosphate buffered saline,PBS)组、多聚右旋赖氨酸(poly-D-lysinehydrobromide,PDL)组迁出的细胞数量更多,迁移距离更远,差异具有明显统计学意义;(3)细胞划痕8、12、24h后,细胞在层粘连蛋白、基质胶上的面积愈合率比在PBS上的高,差异具有统计学意义;(4)免疫细胞化学结果显示迁移能力较强的PASMCs中肌动蛋白在与细胞运动方向相一致的边缘聚集现象越明显;vinculin(粘附斑的标记物)染色显示,种植于层粘连蛋白和基质胶上的PASMCs中,vinculin的分布较PBS和PDL上的更少。上述结果表明:玻片倒扣法是一种适合研究VSMCs迁移的方法;层粘连蛋白和基质胶可能通过抑制粘附斑的形成和调节骨架蛋白,促进VSMCs迁移。

抑制Beclin 1促进H_2O_2诱导的神经胶质瘤U251细胞凋亡

氧化应激能够引起细胞自噬和凋亡同时发生,但其中细胞自噬的作用仍不十分明确,研究表明Beclin1作为调节前自噬体形成的关键基因,参与了胶质瘤氧化应激的损伤过程。为了探讨自噬在H2O2引起的神经胶质瘤U251细胞损伤中的作用,本文应用真核细胞转染技术将Psilencer3.1-siRNA-Beclin1重组质粒转入人神经胶质瘤U251细胞,同时分别设立转染空质粒阴性对照组和转染试剂阴性对照组。于24h后收集细胞,分别提取细胞总蛋白,通过Western blot检测Beclin1、Bcl-2和Bax蛋白表达,鉴定转染效率。应用1mmol/LH2O2作用Beclin1-siRNA细胞株,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色检测细胞自噬空泡的变化;Western blot检测自噬蛋白LC3表达;流式细胞仪PI/AnnexinV-FITC双染色法检测细胞凋亡率。结果显示,Beclin1-siRNA重组质粒明显降低Beclin1蛋白表达,并且对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达无明显影响;与正常对照组相比,1mmol/LH2O2作用的神经胶质瘤U251细胞自噬空泡明显集聚,LC3-II蛋白表达增强,细胞凋亡率增加(P<0.05);与1mmol/LH2O2组相比,转染Beclin1-siRNA质粒后降低了H2O2引起的自噬空泡集聚,LC3-II蛋白表达下降,但细胞凋亡率显著增加(P<0.05);H2O2与自噬特异性抑制剂3-methyladenine(3-MA)联合应用时,U251细胞凋亡率亦显著增加(P<0.05)。上述结果表明,Psilencer3.1-siRNA-Beclin1转染神经胶质瘤U251细胞后,可有效抑制Beclin1的蛋白表达,降低H2O2引起的细胞自噬水平,增加细胞凋亡率,与添加自噬抑制剂3-MA的结果一致。本研究提示自噬在氧化应激过程中是一种细胞的自我保护机制,抑制自噬促进了细胞凋亡的发生。

cAMP介导血清引起的嗅鞘细胞形态变化

嗅鞘细胞是一类兼有星形胶质细胞和雪旺细胞特性的胶质细胞。培养的嗅鞘细胞存在两种能相互转化的形态亚型,然而转化的分子机制并不清楚。本研究旨在建立一种研究离体培养嗅鞘细胞形态转化的方法,基于该方法研究其相互转化的机制。采用原代培养大鼠嗅鞘细胞和免疫细胞化学技术,观察在有、无血清培养或给予双丁酰-环核苷酸(dB-cAMP)药物条件下嗅鞘细胞形态,并统计雪旺样和星形样嗅鞘细胞亚型的比例。结果显示:(1)在无血清培养条件下,(95.2±3.7)%嗅鞘细胞呈雪旺样形态,(4.8±3.7)%呈星形样形态;而在10%血清培养条件下,(42.5±10.4)%嗅鞘细胞呈雪旺样形态,(57.5±10.4)%呈星形样形态,随后换回无血清条件下培养24h,(94.8±5.0)%嗅鞘细胞呈雪旺样形态,(5.2±5.0)%呈星形样形态。(2)有无血清的培养条件并不影响嗅鞘细胞标记物p-75和S-100的表达。(3)在正常(10%)血清培养情况下,cAMP类似物dB-cAMP抑制F肌动蛋白应力纤维(F-actin stress fibers)和黏着斑(focal adhesion)形成,抑制血清引起的嗅鞘细胞形态变化,雪旺样细胞比例增加,并显著增加突起数目,促进突起生长。这些结果表明血清培养条件下,胞浆cAMP水平通过调节F肌动蛋白应力纤维和黏着斑形成,诱导嗅鞘细胞形态可塑性。