多重耐药大肠埃希菌临床株质粒介导的喹诺酮类耐药机制研究

喹诺酮类属于化学合成的抗菌药物，既是临床最常用的抗菌治疗剂，也在畜牧业和养殖业中广泛使用。鉴于细菌对喹诺酮类抗菌素的耐药率逐年上升，尤其是某些最常见的条件致病菌如大肠埃希菌对其表现出的较广泛耐药率和多重耐药性，已经引起学术界的关注。

多重耐药大肠杆菌耐药基因与整合子遗传标记基因间的相关性

【目的】对多重耐药大肠埃希菌(Escherichia coli)临床株的β-内酰胺酶类(β-lactamases,BLs)和氨基糖苷钝化酶类(aminoglycoside modifying enzymes,AMEs)耐药基因与Ⅰ-Ⅲ类整合子遗传标记基因之间的相关性进行研究。【方法】采用VITEK-GNS药敏卡测定136株E.coli对14种抗菌素的敏感性;纸片扩散法确认超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)产酶株;PCR法检测BLs、AMEs相关耐药基因及Ⅰ-Ⅲ类整合子遗传标记基因;接合传递试验和质粒提取对16S rRNA甲基化酶基因进行初步定位。【结果】136株多重耐药的E.coli ESBLs产生率高达70.59%(96/136),产酶株对氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素、亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦以外的其余9种抗菌素的耐药率显著高于非产酶株(P<0.05)。BLs耐药基因总检出率为96.32%(131/136),1株外膜通道蛋白oprD2基因缺失,AMEs耐药基因总检出率为100%(136/136),Ⅰ类整合子遗传标记基因qacEΔ1-sul1的检出率为94.12%(128/136),未检出Ⅱ类与Ⅲ类整合子基因。BLs基因和AMEs基因与qacEΔ1-sul1遗传标记基因的同时携带率分别为90.44%(123/136)和94.12%(128/136),两类同时携带率之间的差异不具统计学意义(P>0.05),上述两类耐药基因与qacEΔ1-sul1遗传标记基因的三者同时携带率为90.44%(123/136)。此外,还检出16S rRNA甲基化酶基因12株(8.82%),其中,armA与rmtB的检出率分别为2.21%和7.35%,未检出rmtA、rmtC和rmtD。接合试验与质粒图谱结果初步表明:armA和rmtB编码基因位于约23 kb的质粒上,其耐药质粒在同种菌间的传递率高达83.3%(10/12)。【结论】多重耐药E.coli临床株的BLs基因、AMEs基因与qacEΔ1-sul1遗传标记基因三者同时携带率高达90.44%,表明多重耐药的形成在三者间具有密切的相关性;实验结果还显示:E.coli临床株的多重耐药性形成和传播与Ⅱ和Ⅲ类整合子基因无关。另外,16S rRNA甲基化酶基因携带率为8.82%(armA 2.21%和rmtB 7.35%),并初步证明armA和rmtB编码基因位于约23 kb的质粒上,其耐药质粒在同种菌间的传递率高达83.3%(10/12)。

Pro167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶的动力学特征

目的 对Pr0167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的动力学特征进行分析与评价.方法 以携带CTX-M-14基因的大肠埃希菌临床株为模板,克隆目的 基因,重组工程菌,并表达CTX-M-14型ESBL.进而采用基于重叠延伸PCR法的定点突变技术,将CTX-M-14型ESBL的167位点Pro（P）分别突变为Gly（G）、Gln（Q）、Ser（S）和Thr（T）,重组构建P167G、P167Q、P167S和P167T四株突变型的CTX-M-14工程菌.表达与纯化野生型、重组型和突变型CTX-M-14型ESBL,检测其水解β-内酰胺类抗菌素的酶动力学参数（Kcat、Km和Km）.结果 对野生型与重组型CTX-M-14型ESBL的酶动力学参数进行配对t检验,结果显示两者Kcat（t=1.796,P=0.123）、Km（t=0.559,P=0.596）、Kcat/Km（t=0.893,P=0.406）间的差异无统计学意义（P〉0.1）.与重组CTX-M-14型ESBL相比,P167S突变型酶对头孢他啶的Km值大幅降低,为突变前的1/16（8.39/134.85）;Kcat和Km值分别为突变前的2.87倍（1.81/0.63）和43.6倍（0.218/0.005）;且对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松和头孢噻肟的Kcat/Km值都呈现出显著减小的趋势（P〈0.05）.与重组CTX-M-14 ESBL相比,P167Q和P167G突变型酶对头孢他啶的Kcat值亦大幅减小（P〈0.01）,而P167T突变型对头孢他啶的酶动力学参数无明显变化.结论 重组型与野生型CTX-M-14 ESBL之间各项酶动力学参数的差异无统计学意义（P〉0.1）.而P167S位点的突变,不仅增强了CTX-M-14型ESBL对头孢他啶的亲和力,也加快了酶-底物复合物的转换速率.通过对Pr0167位点4种突变型酶的动力学参数比较,初步说明突变型CTX-M ESBL对头孢他啶所具备的高水解活性机制,不能简单地归结于Pro167位点被小侧链氨基酸残基取代而导致酶活性中心空间扩大的解释.