银离子固相萃取-气相色谱法检测乳脂肪中的反式脂肪酸

建立了分离反式油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、亚麻酸(C18∶3)的银离子固相萃取-气相色谱(Ag+-SPE/GC)方法,并应用于乳脂肪中反式脂肪酸的检测。采用自制的银离子固相萃取柱对样品进行预分离,总脂肪酸甲酯化后上样,依次经9mL甲苯-正己烷(体积比5∶95)、8mL甲苯-正己烷(体积比17∶83)、6mL甲苯-乙酸乙酯(体积比17∶83)、10mL甲苯-乙酸乙酯(体积比30∶70)洗脱并分别收集洗脱液,采用气相色谱分别进行检测。结果显示,除了反式亚麻酸的回收率为69.9%～101.0%、相对标准偏差(RSD)为11.0%～18.1%外,其余的反式脂肪酸的回收率均为88.4%～107.2%、RSD为1.2%～11.9%。该方法通过特异性固相萃取的方法对样品进行前处理,较好地避免了样品中顺式及饱和脂肪酸对反式脂肪酸检测的干扰。

5种乳腺癌相关指标血清检测的临床价值分析

目的了解hMAM、NF-κB、CA153、OPN和MMP-13 5种血清指标诊断乳腺癌的临床价值。方法 ELISA法检测hMAM、NF-κB、OPN和MMP-13,雅培i2000全自动发光仪检测CA153,比较乳腺癌组(59例)和正常对照组(35例)外周血中5种指标的表达特点,验证其临床价值。结果与正常对照组比较,hMAM、NF-κB、CA153和OPN在乳腺癌中高表达,且差异有统计学意义;对乳腺癌的诊断价值,从高到低分别为:hMAM、NF-κB、CA153和OPN。不同病理分期中,CA153和OPN在乳腺癌晚期显著升高。结论 hMAM、NF-κB、CA153和OPN对乳腺癌诊断具有一定的价值,其中hMAM更好;当CA153和OPN明显升高,可能提示乳腺已进入中晚期。

细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测7型腺病毒感染

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的检测7型腺病毒(ADV7)感染的技术。方法A549细胞分离培养鼻咽分泌物中的腺病毒纯化后,以感染复数(MOI)为0.1、0.5、5.0和10.0的纯化病毒感染A549细胞,分别在感染后3、6、12和24h提取总RNA进行ADV7E1A基因的实时荧光RT-PCR检测并测序验证;最后用该法直接检测鼻咽分泌物标本中的7型腺病毒。结果实时荧光RT-PCR最快可在感染后3h检测出0.5MOI病毒感染的早期转录物;感染后6h可检测出0.1MOI病毒感染的早期转录物;鼻咽分泌物标本直接感染后6h即可检测到病毒的早期转录物。结论细胞培养结合实时荧光RT-PCR法能快速、灵敏、特异地检测出感染性的7型腺病毒,具有一定的推广应用价值。

囊性纤维化跨膜转导调节因子表达率与人精子受精能力的关系

目的:研究人精子囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tanceregulator,CFTR)表达率与精子受精能力间的关系。方法:运用间接免疫荧光法及蛋白印迹分析法研究CFTR在人精子上的表达及其在不同类型(生育组、不明原因性不育组及不育组)精子上的表达率情况。结果:通过间接免疫荧光法发现CFTR表达在人精子赤道板上,蛋白印迹分析进一步证实人精子中存在CFTR,分子量为170kD;采用间接免疫荧光技术,CFTR在生育组、不明原因性不育组及不育组(包括畸形精子症、弱精症、少精症)上的表达率有显著差异:CFTR在生育组精子上的表达率(88.13%±3.79%)远高于不明原因性不育组(52.93%±15.36%)及不育组(35.89%±20.41%)(P<0.01)。结论:CFTR表达率下降与人精子受精能力降低有关。

应用实时荧光聚合酶链反应检测婴幼儿腹泻标本中的腺病毒

目的建立实时荧光聚合酶链反应（Real-time PCR）方法检测腺病毒，并分析浙江省温州地区散发性婴幼儿腹泻患者不同型别腺病毒的感染情况。方法根据GenBank中腺病毒六邻体基因序列设计一对通用引物，建立Real-time PCR方法检测婴幼儿腹泻标本中腺病毒DNA，并与免疫层析法比较；同时对Real-time PCR方法检测阳性的标本进行PCR产物测序和病毒分离培养及酶切鉴定。结果建立快速、特异检测婴幼儿腹泻标本中腺病毒DNA的Real-time PCR技术。157份婴幼儿腹泻标本中免疫层析法检测阳性3份，阳性率为1．91％；Real-time PCR检测阳性5份，阳性率为3．18％（5／157）；154份免疫层析法检测阴性标本中，有2份Real-time PCR法检测为阳性。5份Real-time PCR检测阳性标本经测序鉴定，Ad3型占1．91％（3／157），Ad7型占1．27％（2／157）；经病毒分离培养检出阳性2例，酶切鉴定为Ad3型。结论Real-time PCR技术结合PCR产物直接测序分析具有敏感、特异等优点，适用于腹泻标本中腺病毒的检测及分型。2008年2—4月浙江省温州地区散发性婴幼儿腹泻的腺病毒主要为Ad3型和Ad7型。

临床分离的金黄色葡萄球菌mecA和qacA/B基因检测

目的了解临床分离的金黄色葡萄球菌对常用抗菌药物的耐药性及mecA基因和qacA/B基因携带现状。方法收集临床分离的111株金黄色葡萄球菌,采用K-B药敏纸片法检测其对抗菌药物的耐药性,用聚合酶链反应检测mecA和qacA/B基因。结果 111株金黄色葡萄球菌对青霉素G、氨苄西林、红霉素和苯唑西林的耐药率较高,分别为97.3%、93.4%、86.5%和82.9%,对万古霉素和替考拉宁均敏感;mecA基因和qacA/B基因的检出率分别为63.9%和13.5%;将部分菌株的mecA和qacA/B基因扩增产物进行测序,并将测序结果登录NCBI进行比对。结论临床分离的金黄色葡萄球菌mecA基因检出率较高且呈多药耐药趋势;大部分MRSA和少部分MSSA中携带消毒剂抵抗基因qacA/B;临床应重视由此类金黄色葡萄球菌所引起的感染的诊断、治疗和医院感染的控制,并合理使用消毒剂。

浙江省2005-2010年风疹病毒分子流行病学研究

目的分析2005--2010年浙江省风疹病毒流行株的病原学与分子流行病学特征。方法采集该期间风疹疫情中的疑似患者标本，于Vero细胞上分离病毒。采用巢式RT-PCR扩增流行株E1、E2和C三个结构基因片段，对扩增产物进行序列测定与分析。结果从52例临床标本中共分离到风疹病毒流行株7株，除RVi／Zhejiang．CHN／23．08株为2B基因型外，其余6株均属于1E基因型。基因进化树上，1E基因型流行株分别与香港、海南地区流行株具有最近亲缘关系，而2B基因型流行株与BuenosAires．ARG／46．08位于同一分支。遗传距离分析表明，浙江2B型流行株与全球其他地区流行株间的遗传距离（0．011）小于与中国流行株（0．023）间的遗传距离。浙江风疹流行株与中国风疹疫苗株BRDⅡ在核苷酸水平上的同源性为C〉E2〉E1，而氨基酸水平上的同源性为E1〉C〉E2，对应存在3、11和23个氨基酸的变异。各位点氨基酸熵值表明，E1蛋白上仅存在一个易变位点（熵值〉0．600），而E2蛋白上有7个易变异位点和1个高变异位点（熵值〉1．000）。结论2005--2010年浙江省存在两种基因型风疹病毒流行，1E为优势基因型，2B可能为境外输入株。流行株E1基因氨基酸序列相对保守，而E2基因氨基酸变异较大，在风疹病毒流行病学监测中除关注E1基因外，应开展对结构基因E2和C的研究。

高滴度感染力H5N1亚型禽流感病毒假病毒颗粒的制备

利用一个瞬时共转染系统,将H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白整合到鼠白血病病毒假病毒颗粒表面,包装成表达HA与NA的假病毒颗粒,通过透射电子显微镜形态学观察、感染滴度分析、血凝试验和中和试验研究其生物学特性。研究获得了高滴度感染力的H5N1假病毒颗粒(H5N1Pseudotyped particle,H5N1Pp),H5N1Pp的感染力滴度为108Pp/mL,形态、血凝活性及中和特性均与野生H5N1病毒相似,结果为H5N1病毒受体、HA与NA的功能、中和抗体、抗病毒药物开发研究的开展建立了平台。

结核分枝杆菌CysA2抗原的基因克隆、表达及在血清诊断中的应用

目的克隆并构建结核分枝杆菌CysA2基因原核表达系统,建立基于rCysA2的ELISA并检测rCysA2-ELISA在肺结核患者血清学诊断中的敏感性和特异性。方法采用PCR扩增CysA2基因,构建CysA2基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rCysA2表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rCysA2,免疫印迹鉴定rCysA2的免疫反应性。以rCysA2为包被抗原,建立rCysA2-ELISA并用于检测132例血清抗体,其中涂片阳性和阴性肺结核患者血清分别占96例和36例,非肺结核肺部疾病病人血清抗体30例,健康对照血清50例。结果克隆的CysA2基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rCysA2表达量为细菌总蛋白的25.4%。提纯的rCysA2在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。rCysA2-ELISA检测涂片阳性和涂片阴性的肺结核患者血清抗体检出率分别为63.5%和61.1%,50例健康对照全部阴性、30例非肺结核肺部疾病患者1例呈现阳性,此方法的灵敏度为62.9%(83/132),特异性为98.8%(79/80)。结论本研究成功地克隆并构建了结核分枝杆菌CysA2基因及其原核表达系统。以rCysA2为包被抗原的rCysA2-ELISA方法有较高的灵敏度和很好的特异性,能有效检测涂片阴性患者血清抗体,rCysA2有望成为结核病血清诊断的有效候选抗原之一。

采用随机聚合酶链反应方法对临床样本中未知核糖核酸病毒检测的研究

目的探索一种不依赖于病毒培养,直接对临床样本中未知核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)病毒作出鉴定的分子生物学方法。方法对经前处理后的临床样本提取病毒RNA,进行随机聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增,通过对扩增产物的纯化、克隆、测序以及序列的在线比对,根据同源性确定核酸片段的来源,并最终实现对未知病毒的鉴定。对临床样本的前处理以及前处理方法的优化,即通过冻融、离心、过滤、聚乙二醇浓缩,以及核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的处理,尽可能地去除样本中的无关核酸,以增大病毒核酸在样本中所占比例,提高阳性检出率。结果通过对样本前处理方法的改进,从病毒载量为4.8×103Copy/ml(拷贝/毫升)的含漱液样本中,以70%的阳性克隆率检测出未知RNA病毒。结论所建立的方法能提高对RNA病毒鉴定的阳性率,这将在不明原因传染病病原体的鉴别诊断中,发挥重要的作用。