SA/hIL24双功能融合蛋白的制备及其生物学活性的鉴定

目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素24融合蛋白(SA/hIL24),并鉴定其生物学活性。方法:通过RT-RCR扩增hIL-24基因序列,构建pET24a-SA-hIL24和pET21a-hIL24-SA重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达的融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析和凝胶过滤层析纯化、透析复性。MTT法检测融合蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用,流式细胞仪分析融合蛋白对已生物素化的小鼠膀胱癌MB49细胞的锚定修饰效率。结果:成功构建两种融合蛋白的重组表达质粒,在大肠杆菌中实现高效表达,表达量分别占菌体总蛋白的20%和35%,二次纯化后SA/hIL24融合蛋白纯度可达95%以上。SA/hIL24融合蛋白可高效结合至已生物素化的MB49肿瘤细胞表面(表面锚定修饰率大于90%),hIL24-SA融合蛋白可以剂量依赖的方式抑制Hela细胞的生长,而SA-hIL24融合蛋白对Hela细胞没有明显的抑制生长作用。结论:SA/hIL24融合蛋白的制备为hIL-24表面锚定修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供了基础。

hIL-15-SA双功能融合蛋白的制备

目的:对双功能融合蛋白hIL-15-SA的发酵及纯化工艺进行研究。方法:采用发酵罐高密度发酵hIL-15-SA工程菌,通过镍柱亲和层析及阴离子交换层析纯化目的蛋白。免疫印迹分析产物,淋巴细胞增殖试验以及细胞锚定试验检测双功能融合蛋白hIL-15-SA的生物学活性。结果:采用半合成培养基,以3%的接种量,pH值为7.2发酵可得到湿菌47 g/L,21.15 g/L包涵体。经纯化后目的蛋白纯度为97%。细胞增殖试验和细胞表面锚定修饰试验表明,经纯化复性的hIL-15-SA融合蛋白具有双重生物活性。结论:本研究获得了高产量、高纯度的hIL-15-SA双功能融合蛋白,为后续的体内生物学功能研究奠定了基础。

链亲和素标记的白细胞介素4双功能融合蛋白锚定治疗小鼠浅表性膀胱癌

目的探讨链亲和素标记的白细胞介素4（IL-4-SA）双功能融合蛋白治疗小鼠浅表性膀胱癌的效果。方法制备IL-4-SA双功能融合蛋白，测定其体外生物学活性。建立小鼠浅表性膀胱癌模型，膀胱经生物素化后给予IL4-SA灌注治疗，观察小鼠生存期，并以链亲和素标记的绿色荧光蛋白（GFP—SA）＋IL-4和磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照组。检测各组小鼠脾细胞的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性和CD8＋肿瘤浸润淋巴细胞。结果IL4．SA能够锚定于生物素化的膀胱表面达5d以上。在MIM9细胞种植后的第80天，PBS组小鼠全部死亡，GFP-SA＋IL-4组小鼠存活2只，而IL4-SA组小鼠存活5只。在肿瘤特异性杀伤实验中，在效靶比为1：1、25：1、50：1时，PBS组小鼠的CTL杀伤率分别为（3．3±0．6）％、（7．3±0．6）％和（12．7±2．1）％，GFP．SA＋IL4组小鼠的CTL杀伤率分别为（4．3±0．6）％、（9．0±1．0）％和（14．3±1．5）％，而IL4-sA组小鼠的CTL杀伤率分别为（11．3±1．2）％、（22．7±1．5）％和（31．0±3．0）％，IL4-SA组与PBS组和GFP—SA＋IL-4组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。CD8＋淋巴细胞检测结果显示，PBS组和GFP．SA＋IL4组的肿瘤组织内仅有少量的CD8＋淋巴细胞浸润，而IL-4-SA组则有较多的CD8＋淋巴细胞浸润。结论IL4-SA锚定膀胱表面能够产生强烈、持久的免疫应答反应，有可能成为浅表性膀胱癌的一种新灌注治疗方法。

腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备

利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD（可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白）蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量（MOI）（0-1 000）感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI（0~1 000）感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白。该表达系统的特点是生产规模易于放大,适应无血清培养,可以反复多次收获目标蛋白。

重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。

制备可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的两种细胞培养工艺比较

利用7．5L生物反应器篮式贴壁培养和全悬浮批式培养CHO工程细胞株表达可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部（sTNFRII-gAD）融合蛋白，比较这两种培养方法的产率，以便优化高效表达sTNFRII—gAD融合蛋白的制备工艺。篮式贴壁培养首先小规模培养CHO工程细胞株，待细胞增殖到一定密度后以3×105-4×10^5cells／mL密度接种生物反应器贴壁培养3d，调换成不含血清的LK021培养基继续培养4d。而全悬浮无血清批式培养则以3×10^5-4×10^5cells／mL密度的CHO工程细胞株接种于生物反应器，连续培养7d。培养过程实时监测培养条件，维持pH和DO的稳定。分别收集细胞上清，离心去细胞后用Pellicon切相流超滤系统对蛋白进行浓缩，并通过DEAE离子交换柱进行纯化。结果显示，篮式贴壁培养和全悬浮批式培养均成功表达了sTNFRII-gAD融合蛋白，产量分别为8．0mg／L和7．5mg／L、纯度分别为95％和98％，从而为sTNFRII-gAD融合蛋白的中试工艺研究提供了一定的基础。