苦瓜蛋白诱导K562/A02细胞凋亡

目的:观察苦瓜蛋白对K562/A02细胞凋亡受抑逆转作用及其分子机制。方法:CCK-8法测定苦瓜蛋白对耐药细胞K562/A02的IC50值,细胞形态学和AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡,流式细胞法测定P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达及caspase-3和caspase-8活性。结果:苦瓜蛋白显著抑制K562/A02耐药细胞的增殖;经苦瓜蛋白处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变,AnnexinV/PI双染法显示凋亡细胞明显增加;P-gp蛋白表达下降,caspase-3和caspase-8活性显著增强。结论:苦瓜蛋白能诱导K562/A02耐药细胞凋亡,逆转耐药白血病细胞P-gp高表达所介导的细胞凋亡抑制。

苦瓜蛋白在K562/A02细胞生长抑制和凋亡中的作用及其机制研究

目的:研究苦瓜蛋白(momordin)诱导人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02的凋亡及作用机制。方法:采用CCK-8法检测细胞生长抑制率,FCM法和细胞形态学检测细胞凋亡,FCM法检测P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、p53、bcl-2和caspase-3蛋白表达水平,并运用caspase-8活性检测试剂盒检测caspase-8的活性。结果:苦瓜蛋白能抑制K562/A02耐药细胞的生长且呈剂量依赖关系,并能诱导细胞凋亡,能使P-gp、p53和bcl-2的表达下降,而使caspase-3和caspase-8活性增强。结论:苦瓜蛋白可逆转耐药细胞株K562/A02的细胞凋亡受抑性,主要机制可能与其下调p53、P-gp和bcl-2的表达以及提高caspase活性有关。

CD28/CTLA-4:B7在特发性血小板减少性紫癜患者外周血淋巴细胞中的表达及意义

目的:探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者外周血淋巴细胞CD28、CTLA-4(CD152)、B7-1(CD80)及B7-2(CD86)的表达及意义。方法:采用免疫荧光标记和流式细胞术检测41例ITP患者和40例健康对照者外周血CD3+CD28+细胞、CD3+CD152+细胞、CD80+CD19+细胞和CD86+CD19+细胞分别占淋巴细胞的比例及血小板表面相关抗体水平,进行2组对比、分析。结果:与正常对照组相比,急性ITP患者外周血CD3+CD28+细胞和CD3+CD152+细胞差异无统计学意义(P>0.05),CD80+CD19+细胞增多(P<0.05),CD86+CD19+细胞显著增多(P<0.01),慢性ITP患者CD86+CD19+细胞增多(P<0.05);急性ITP患者外周血CD86+CD19+细胞较慢性ITP患者增多(P<0.05);与正常对照组相比,急性ITP患者PAIg's、PAIgG和PAIgM水平显著增高,慢性ITP患者PAIgG水平增高;CD80、CD86表达与PAIgG水平之间存在显著的相关性(均P<0.01)。结论:ITP患者外周血B淋巴细胞上CD86和CD80表达均异常,可能与其发病相关。

慢性乙型肝炎患者外周血CD4^+CD25^+调节性T细胞数量与肝脏疾病慢性化进展关系的研究

目的探讨慢性乙型肝炎患者(chornic hepatitis B,CHB)外周血中CD4+CD 25+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的数量与肝脏慢性疾病进展的关系。方法流式细胞术检测抗病毒治疗后45例CHB患者(根据B超将其分为3组,其中B超提示肝脏无异常改变的单纯CHB组15例,提示慢性肝病改变的CHB慢性肝病组15例,提示肝硬化改变的CHB肝硬化组15例)与B超均提示肝脏无异常改变的15例慢性乙型肝炎病毒携带者(asymptomic HBV carriers,ASCs)以及15例健康成年人(normal control,NC)对照外周血中CD4+CD25+Treg的变化,并分析Treg与患者年龄,HBeAg定量,ALT、AST、TGF-β1水平的相关性。结果外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+淋巴细胞的比例在抗病毒治疗后单纯CHB组为(4.03±1.36)%,与NC组(4.02±1.14)%相比差异无显著性(t=0.0223,P>0.05),与ASCs组(5.26±1.25)%相比显著减少(t=-2.2872,P<0.05);CHB慢性肝病组为(5.65±2.01)%,CHB肝硬化组为(5.32±1.47)%,与NC组、单纯CHB组比显著增高(t值分别为3.0351、3.0129、2.4269、2.4046,均P<0.05)与ASCs组相比差异无显著性(t值分别为0.7257、0.1174,均P>0.05);CHB慢性肝病、肝硬化组间相比差异无显著性(t=0.6083,P>0.05)。Treg的数量与年龄、AST、TGF-β1水平呈正相关(r分别为0.327、0.324、0.306,P分别为0.004、0.005、0.008)。结论 Treg在低水平AST时CHB患者外周血中的数量的增高对抗病毒治疗后的CHB患者更能反映其肝脏慢性损伤程度,Treg可能参与了慢性HBV感染后肝脏疾病慢性化进展的过程。

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡及其对Bcl-2和突变型P53蛋白表达的影响

目的：探讨Bcl-2和突变型P53蛋白在三氧化二砷（As2O3）诱导K562细胞凋亡中的作用及机制。方法：分别以1、2、4、8、16μmol/L的As2O3诱导K562细胞凋亡,MTT法检测24、48、72h时细胞增殖抑制率,DNAl-adder法检测细胞凋亡,AnnexinV/PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率,流式细胞术检测Bcl-2和突变型P53表达。结果：不同浓度的As2O3对K562细胞具有增殖抑制作用,且呈现时间剂量依赖性。DNA ladder及AnnexinV/PI法结果显示4~16μmol/L的As2O3作用24h均可诱导K562细胞凋亡,且呈剂量依赖性。As2O3诱导K562细胞凋亡同时伴随着胞浆Bcl-2和突变型P53表达降低。结论：As2O3可诱导K562细胞凋亡,Bcl-2和突变型P53表达降低可能与其有关。

流式免疫磁珠法检测BCR-ABL融合蛋白在白血病中的意义

目的:探讨流式免疫磁珠(CBA)法检测白血病患者BCR-ABL融合蛋白的方法学评价及其意义。方法:采用CBA法检测64例白血病患者和10例正常人外周血白细胞中BCR-ABL融合蛋白表达,同时与实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和荧光原位杂交(FISH)法比较。结果:正常人外周血白细胞BCR-ABL融合蛋白平均荧光强度(MFI)是10.58±3.88,64例白血病患者中BCR-ABL阳性25例,仅1例B-ALL患者检测结果与RQ-PCR结果不一致,与FISH检测结果完全一致。结论:CBA法检测BCR-ABL融合蛋白方法可靠,重复性好,简单,快速,具有良好的临床应用前景。

慢病毒介导TIEG1基因乳腺癌靶向载体的构建及活性测定

目的:构建慢病毒介导的TIEG1基因乳腺癌特异性靶向载体,并鉴定其活性。方法:将乳腺癌特异性survivin启动子片段和TIEG1基因先后克隆进带有绿色荧光蛋白的慢病毒载体中,构建survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体,酶切及测序鉴定。包装纯化慢病毒颗粒,感染人脐静脉内皮细胞HUVEC和乳腺癌细胞SK-BR-3,观察绿色荧光蛋白的特异性表达。结果:成功构建带有肿瘤特异性survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体。感染细胞后,乳腺癌SK-BR-3细胞可观察到绿色荧光表达,而人正常脐静脉内皮细胞基本无表达。半定量RT-PCR证实TIEG1基因在乳腺癌SK-BR-3细胞中过表达。结论:构建的survivin启动子驱动的慢病毒表达载体具有一定的肿瘤特异性,将为实现以慢病毒为载体的TIEG1基因肿瘤靶向治疗提供良好的实验基础。

榄香烯对人胃癌细胞SGC-7901的体外生长及CD_(44v6)、CD_(44)的影响

目的:探讨榄香烯对人胃癌细胞株SGC-7901体外生长及细胞黏附分子CD44v6、CD44的影响。方法:Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测榄香烯对SGC-7901细胞增殖的影响;采用DAPI荧光染色法进行细胞核形态学分析;流式细胞仪检测细胞膜表面CD44v6、CD44表达。结果:榄香烯抑制SGC–7901细胞增殖,其呈量效和时效关系;DAPI染色显示榄香烯诱导SGC-7901细胞凋亡并显示特征性的凋亡细胞核形态;流式细胞仪检测结果显示榄香烯20、30、40μg/mL组与对照组相比,SGC-7901细胞膜表面CD44v6表达明显减少(P<0.01),CD44表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:榄香烯能抑制SGC-7901细胞增殖、诱导细胞凋亡,其抗肿瘤转移的机制可能与下调CD44v6表达相关。

新型全肝脏去细胞化流程对细胞外基质及细胞组分残留量影响的研究

组织工程中去细胞化支架的构建,存在着保留细胞外基质和完全去除供体细胞成分的矛盾,如何评价去细胞化流程的效果是解决的关键。本研究采用以TritonX-100为主,辅助以SDS、酶学法、物理冻融法、高低渗法等方法的新型全肝脏去细胞化流程制作去细胞支架,通过免疫组化及电镜观察支架形态结构,ELISA法检测细胞外基质各组分含量,吸光度及Western-blotting法检测供体细胞组分残留量,免疫荧光法检测支架内三维循环培养诱导WBF-344细胞分化。结果表明,该流程很好的保留了胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白等细胞外三维结构;氨基聚糖、HGF、VEGF等细胞外基质保存量分别达正常组织的90%及40%;基本去除残留DNA的同时,相比SF.Badylak et al.法,细胞残留组分量如GAPDH、MCH-I及HMGB-1明显下降,仅为正常组织的10%;WBF-344细胞在支架培养系统内生长良好,白蛋白表达逐渐增强。本研究成功构建了新的、较完善的去细胞化支架制作与评价体系,为干细胞分化在肝脏疾病治疗找到一种新的应用模式,

S100P基因慢病毒表达载体的构建及对结肠癌Caco-2细胞的影响

目的:通过构建S100P慢病毒表达载体,研究其对结肠癌Caco-2细胞的影响。方法:以DLD-1细胞cDNA为模版,PCR扩增S100P基因序列,然后将该序列克隆插入慢病毒载体中,构建S100P慢病毒表达载体,包装产生慢病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染Caco-2细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)技术检测S100P的表达情况;MTT法检测细胞生长变化;细胞平板克隆培养检测其细胞克隆形成能力。结果:构建的慢病毒表达载体Lenti-S100P经酶切和测序鉴定结果正确;携带S100P基因的慢病毒颗粒感染Caco-2后,细胞中S100P基因和蛋白过表达,促进细胞克隆形成能力。结论:本研究成功构建S100P慢病毒表达载体,为深入研究S100P基因的相关功能提供了一定的实验基础。

FHL1在香烟烟雾刺激的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移中的作用

目的:研究FHL1(four-and-a-half LIM domain 1)在香烟烟雾提取物(CSE)刺激的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及迁移中的作用。方法:原代培养PASMCs,分别予CSE及FHL1 siRNA转染干预,分为6组:空白组、阴性转染组、FHL1 siRNA转染组、CSE组、CSE+阴性转染组和CSE+FHL1 siRNA转染组。Real-time PCR法检测FHL1 mRNA的表达,Western blotting法检测FHL1蛋白,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell法测定细胞迁移。结果:CSE刺激导致PASMCs增殖、迁移及FHL1蛋白表达增加(P<0.01),但FHL1 mRNA的表达无明显改变(P>0.05)。FHL1 siRNA转染PASMCs,可降低CSE所致的PASMCs增殖及迁移(P<0.01)。结论:CSE可促进PASMCs增殖与迁移以及FHL1蛋白的表达,抑制FHL1蛋白的表达可减弱CSE对PASMCs增殖和迁移的作用。这些结果表明CSE促进PASMCs增殖和迁移与FHL1蛋白有关。

线粒体膜电位在三氧化二砷诱导K562细胞凋亡中的作用

目的探讨三氧化二砷 （As2O3） 诱导 K562 细胞凋亡的发生机制。方法分别以1、2、4、8、16 μmol/L As2O3 诱导 K562 细胞凋亡，MTT法检测不同时间点细胞增殖抑制率，DNA Ladder 法检测细胞凋亡，Annexin V/PI 染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率，Rhodamine 123 染色流式细胞术检测线粒体膜电位（ΔΨm） 变化，ELISA 法检测胞浆细胞色素C（CYTC）水平，分光光度法检测 Caspase-3 活性，流式细胞术检测 Bcl-2 和 Bax 表达。结果MTT结果显示 As2O3 能抑制 K562 细胞生长，且呈现时间剂量依赖性；4～16 μmol/L 的 As2O3 作用 24 h 均可诱导 K562 细胞凋亡，同时伴有ΔΨm下降，胞浆内 CYTC 蛋白浓度及 Caspase-3 活性增高，胞浆 Bcl-2/Bax 值下降，且均呈剂量依赖性。结论 As2O3 诱导 K562 细胞凋亡可能是通过降低ΔΨm，激活线粒体凋亡途径实现的，Bcl-2/Bax值下降可能与其有关。

基于Logistic回归模型的弥漫性大B细胞淋巴瘤分型研究

目的:在免疫组化分型的基础上,探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤患者石蜡标本基因表达与免疫组化分型之间的关系。方法:收集弥漫性大B细胞淋巴瘤患者石蜡切片,常规免疫组化检测CD10、Bcl-6和MUM1,按Hans分类标准进行亚型分类。石蜡组织中提取RNA,real-time PCR法检测Bcl-2、CCND2、LMO2、FOXP1、Bcl-6、HGAL、FN1、CCL3、MME、MUM1和REL基因的表达。利用Logistic回归建立预测模型,并用ROC曲线对其应用价值进行评价。结果:免疫组化结果显示,CD10阳性率为17.07%,Bcl-6阳性率为78.05%,MUM1阳性率为60.98%,Hans标准分型GCB型24.39%,non-GCB型75.61%。Logistic回归模型单因素分析结果表明,MME、LMO2和Bcl-2基因与DLBCL的免疫分型有关,P<0.05;多因素逐步回归分析显示,MME、LMO2和Bcl-2有显著回归效果,建立预测模型公式P=e-3.946-0.687×Bcl-2+0.199×MME+0.421×LMO2/(1+e-3.946-0.687×Bcl-2+0.199×MME+0.421×LMO2)。ROC曲线显示,该模型的曲线下面积为0.970,灵敏度为0.900,特异度为0.968。该模型判断DLBCL分型与免疫组化的总符合率为95.1%。结论:从石蜡中提取RNA,real-time PCR检测基因表达,建立Logistic回归模型,利用该模型对DLBCL分型是可行的。

抗CD20scFv—Fc—CD28／ξ基因修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的研究

目的研究重组抗CD20scFv—Fc—CD28／ξ基因修饰T淋巴细胞在杀伤Raji细胞时T细胞活化情况和诱导Raji细胞凋亡的变化，进一步探讨特异基因修饰T细胞杀伤淋巴瘤细胞的机制。方法将重组质粒转染至PA317细胞中，用转染成功的PA317培养液感染外周血T淋巴细胞后，用800μg／ml的G418筛选1周后杀伤Raji细胞，分别在不同时间点用流式细胞仪检测Raji细胞Bcl-2的阳性率，用ELISA检测培养上清液中的IL-10、IFN-γ。结果Raji细胞Bcl-2的阳性率在24h内就明显下降，72h内由98．43％下降到38．45％，下降幅度明显高于对照组和空白组。72h检测IL-10发现实验组为100．3pg／ml，明显低于对照组（210．88pg／ml）和空白组（286．71pg／m1），同时IFN-γ的分泌量（1487．23pg／ml）也显著高于对照组。结论抗CD20介导的T细胞靶向杀伤Raji细胞不需要CD28的协同刺激。CD28和CD3ξ同刺激可增强T细胞抑制Raji细胞IL-10表达使其降低Bcl-2的表达从而加速靶细胞的裂解。CD28／ξ在没有外源协同刺激分子B7／CD28时能充分激活T细胞，促进其分泌IFN-γ，增强了抗CD20修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的能力。

非酒精性单纯性脂肪肝患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞数量变化及临床意义

目的探索非酒精性单纯性脂肪肝（NAFL）患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞（Treg）数量变化与临床意义。方法流式细胞术检测50例NAFL患者以及50例健康对照者外周血CD4＋CD25＋Treg的变化，采用成组t检验或Mann-WhitneyU检验及Spearman秩相关检验进行统计学分析。结果NAFL患者外周血CD4＋CD25＋Treg占CD4＋T淋巴细胞的比例为（5．39±1．94）％，高于健康对照者的（4．21±1．52）％，差异有统计学意义（t=3．385，P〈O．01）。Treg数量与三酰甘油（TG）、体质指数（BMI）水平呈正相关（r=0．307、0．251，P=0．002、0．012），与高密度脂蛋白胆固醇（HDL—C）呈负相关（r=-0．306，P=0．002）。Treg在高BMI组、高TG组、低HDL，C组、高血压组及代谢综合征（MS）组升高（t=2．294、2．533、3．154、2．010、4．454，均P〈0．05），在高空腹血糖组差异无统计学意义（U=1143．500，P=0．471）。结论NAFL患者外周血Treg数量增加，可能是NAFL作为MS组分之一，与MS时机体处于慢性低度炎性反应状态所表现出的促炎与抗炎平衡紊乱有关。

门静脉高压症脾功能亢进患者CD4＋CD25＋CD127low／-调节性T细胞和Foxp3的表达及其意义

目前，对门静脉高压症脾功能亢进患者肿大脾脏的免疫功能状况及其调节机制尚不清楚。本研究采用流式细胞术和免疫组化法检测门静脉高压症脾功能亢进患者外周静脉血和脾脏组织中CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞及Foxp3的表达，目的在于探讨自然调节性T细胞与门静脉高压症脾功能亢进时脾脏免疫功能的关系，研究调节脾脏免疫功能的可能机制。

S100P与消化道肿瘤的研究进展

S100P是小型钙离子结合蛋白,属于S100家族成员,通过细胞内或细胞外功能调节细胞的各种过程,并参与各种病理过程。越来越多的研究表明,S100P在各种肿瘤细胞中异常表达,并与肿瘤细胞的生长、转移、化疗药物的耐药、新陈代谢以及不良的临床预后有关。该文主要介绍了S100P在消化道肿瘤中的功能和作用机制,及其作为新的诊断和药物治疗靶点的可能性。