基于生物信息学方法的沙眼衣原体主要外膜蛋白免疫优势表位预测及分析

目的预测和分析沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)的免疫优势表位。方法以UniProt蛋白质数据库中检索CtMOMP的氨基酸序列为基础,针对MOMP的理化性质、二级结构、亲水性参数、表面可及性参数、极性参数、抗原性和柔韧性参数,预测其B细胞表位;用SYFPEITHI、IEDB及NetCTI 1.2 server预测MOMP的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位;用RANKPEP及SYFPEITHI预测MOMP的辅助T细胞(Th)表位,筛选分值共同较高的多肽片段作为候选表位。应用GalaxyWEB对MOMP进行三维结构建模分析。结果MOMP由393个氨基酸残基组成,以无规则卷曲及α螺旋为主;推测MOMP的B细胞表位位于N端42~52 aa、161~179 aa、259~265 aa和349~358 aa区段;其CTL表位主要集中于近C端,且以HLA-A*02:01、HLA-A*03限制性表位为主;Th表位各表型候选表位肽数目均较多。结论沙眼衣原体MOMP含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位,其免疫优势表位主要位于N端42~65 aa、155~185 aa区段和C端342~359 aa区段。

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位DNA联合多肽的免疫效应研究

目的研究HPV L1携带EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)多表位DNA联合多肽的免疫效应。方法BALB/c雌性小鼠随机分为4组。pcHPVL1-EBV LMP2DNA免疫组,肌肉注射pcDNA3.1(+)/HPVL1-EBV LMP2多表位DNA,每鼠每次100μg;DNA联合多肽免疫组:先用DNA免疫,每鼠每次50μg,同时皮下注射EBV LMP2多表位肽,每鼠每次5μg;DNA免疫对照组:肌肉免疫空载体pcDNA3.1(+),每鼠每次100μg;多肽免疫对照组:每鼠每次10μg皮下注射不相关多肽。共免疫4次,间隔2周。免疫后第7周收集小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA以及HPVL1特异性抗体IgG;免疫后第9周测定EBV特异性抗体IgG1与IgG2a亚类,同时采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定小鼠脾细胞CTL的杀伤活性。结果多肽联合DNA免疫组小鼠血清EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA A值分别为1.573±0.025和0.436±0.033,单独DNA免疫组分别为1.282±0.051和0.317±0.022,差异有统计学意义(F=80.393,27.722,P<0.05);两免疫组小鼠血清HPV L1特异性IgG A值别为0.648±0.063和0.702±0.023,差异无统计学意义(F=1.952,P>0.05)。DNA免疫组IgG1和IgG2aA值别为0.723±0.023和0.594±0.084,差异无统计学意义(F=6.643,P>0.05),是混合Th1/Th2免疫反应类型;多肽联合DNA免疫组IgG1和IgG2aA值别为0.897±0.042和0.629±0.035,差异有统计学意义(F=72.306,P<0.05),是偏向Th2免疫反应类型。多肽联合DNA免疫组在效靶比为10︰1时,小鼠脾细胞CTL杀伤效应(杀伤率)为27.70%,DNA免疫组为21.50%,差异有统计学意义(F=51.559,P<0.05)。结论多肽联合DNA免疫可产生有效的CTL杀伤效应,更能发挥有效的体液免疫作用,其免疫策略可为EBV相关肿瘤的免疫治疗提供参考。

HPV16 L1在整合型重组毕赤酵母中的表达及病毒样颗粒的纯化

目的构建可稳定表达HPV16L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16L1病毒样颗粒(VLPs)。方法根据酵母密码子偏爱性优化HPV16L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒;重组质粒经Bgl II酶切线性化后,电转化至GS115菌株中,筛选HPV16L1重组毕赤酵母。阳性整合菌株甲醇诱导后,以HPV16L1单克隆抗体检测目的蛋白表达;采用肝素亲和层析法纯化HPV16L1VLPs并进行透射电镜观察。结果PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒。成功构建的HPV16L1重组毕赤酵母甲醇诱导后,Western blot证实重组酵母菌裂解产物存在HPV16L1目的蛋白。肝素亲和纯化后,透射电镜观察到了直径大约55nm的VLPs,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。结论利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了HPV16L1蛋白,并用肝素亲和纯化可快速获得结构完整的HPV16L1VLPs,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。

人宫颈癌SiHa细胞荷瘤裸鼠模型的建立及鉴定

目的:建立人宫颈癌SiHa细胞裸小鼠体表荷瘤模型,并对其成瘤特性进行分析和鉴定。方法:将5×10~6/mL、1×10~7/mL及5×10~7/mL 3个浓度的SiHa细胞悬液分别在3组裸小鼠背部右腋近上肢皮下接种,建立人宫颈癌裸小鼠体表荷瘤模型,观察荷瘤裸鼠的成瘤率并测量肿瘤的大小,5周后取肿瘤组织经病理学方法观察其组织学特性,并采用PCR及免疫组织化学方法对肿瘤组织的HPV16E7 DNA表达进行检测。结果:3组裸小鼠接种SiHa细胞的成瘤率均为100%,5周后肿瘤大小分别达到(77.29±28.34)mm^3、(178.91±61.55)mm^3和(305.11±12.62)mm^3。3个浓度组间肿瘤体积大小差异有统计学意义(P<0.001)。病理学大体观察可见SiHa肿瘤的生长均以局部浸润为主;组织切片观察新生肿瘤细胞特点呈现体积大、核大深染及易见核分裂相的病理性特征;SiHa新生肿瘤组织经PCR检测证实了HPV16E7 DNA阳性,并经免疫组织化学检测证实了HPV16E7蛋白表达阳性。结论:成功建立了SiHa细胞荷瘤裸鼠模型,为人宫颈癌肿瘤靶向治疗及生物学特性研究提供了理想的动物模型。

piRNA在胃癌与正常胃黏膜组织中表达的比较

目的:分析piRNA在胃癌组织与正常胃黏膜组织中表达的差异性。方法:通过新一代高通量测序技术Solexa对胃癌组织和正常胃黏膜组织进行小分子RNA(s RNA)深度测序,并通过生物信息学分析胃癌组织与正常胃黏膜组织中piRNA的表达差异。根据分析结果选取4种piRNA(登录号分别为DQ570956、DQ575659、DQ594126和DQ597128),通过茎环反转录实时定量PCR(简称茎环RT-q PCR)技术验证其存在及其在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达差异。结果:Solexa深度测序结果显示,正常胃黏膜与胃癌组织中测得的piRNA种类在各标本所测得所有s RNA种类中所占的比例差异无统计学意义(Z=0.835,P=0.678);正常胃黏膜组织中测得的piRNA数量在各标本所测得s RNA总量中所占的比例高于胃癌组织,差异有统计学意义(Z=2.167,P=0.042);根据分析结果选取4种piRNA,经茎环RT-q PCR法检测显示,这4种piRNA在胃癌组织中的表达量显著低于正常胃黏膜组织,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:胃癌组织存在多种差异表达的piRNA,且在表达量上与正常胃黏膜组织存在显著性差异,本研究选取的4种piRNA可能参与胃癌的发生发展进程。

金黄色葡萄球菌蛋白A Z结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:制备金黄色葡萄球菌蛋白A(Sp A)Z结构域的原核表达蛋白及其多克隆抗体,并对其进行特异性鉴定。方法:3段Sp A-Z结构域经柔性肽(GS)串联连接构成三串联体(Sp A-3Z),经原核密码子优化后全基因合成,克隆至p ET21a(+)载体,构建p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot法分析鉴定;纯化的Sp A-3Z重组蛋白免疫日本大耳白兔,并分别于免疫前和免疫后采集血清,用ELISA法检测其多克隆抗体的反应和效价,并用Western Blot法分析多克隆抗体结合天然Sp A的特异性。结果:成功构建了p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒;该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Sp A-3Z重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示该蛋白的分子质量约为21 k Da,与理论分子量大小相符;日本大耳白兔经该蛋白免疫后可产生特异性的多克隆血清Ig G抗体,效价可达1:40 000;Western Blot法检测结果显示,在分子质量约42 k Da(天然Sp A蛋白)处出现单一条带,提示兔多克隆血清抗体可识别天然Sp A。结论:Sp A-3Z原核蛋白有较好的免疫原性和抗原性,制备的Sp A-3Z兔多克隆血清抗体Ig G效价高、特异性好,可进一步用于Sp A-Z相关的生物学和免疫学等功能研究。

HPV16型E6重组蛋白的表达及其兔多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a(+)载体,构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至E.coli BL21(DE3)中,通过异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达HPV16 E6-His标签融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后通过Western blot法鉴定;将纯化的HPV16型E6重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,ELISA检测免疫后血清多克隆抗体效价,并用Western blot法和免疫荧光技术分析HPV16 E6兔多克隆抗体的特异性。结果成功构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;在重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,经亲和层析法获得纯化的HPV16型E6重组蛋白,用于免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体,抗体效价为1∶40000,并用Western blot法和免疫荧光技术确认了多克隆抗体的特异性。结论HPV16 E6原核表达成功并制备了HPV16 E6兔多克隆抗体。

MAGE-A3多克隆抗体的制备及在胃癌细胞检测中的应用

目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAGE-A3蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot、免疫荧光技术分析该多克隆抗体的特异性,并用免疫组织化学技术鉴定MAGE-A3兔多克隆抗体在人胃癌细胞免疫检测应用中的可行性。结果:成功构建重组质粒pET21a(+)/MAGE-A3,并经原核表达系统表达MAGE-A3蛋白。SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量大小约为48 k Da,与预期蛋白大小一致,并以His单抗进行Western blot鉴定,出现了特异性的单一条带。MAGEA3蛋白免疫日本大耳白兔,可诱导兔产生特异性抗体,免疫后第8周达到高峰,经Western blot检测显示多克隆血清可特异性识别靶蛋白,出现阳性单一条带;经免疫荧光检测显示,在MAGE-A3阳性细胞A-375(黑色素瘤细胞株)和SGC-7901细胞(胃癌细胞株)的胞浆内出现荧光团块。表明兔多克隆抗体可特异性识别天然的MAGE-A3蛋白。结合免疫荧光结果后经ELISA检测,可认为该多克隆Ig G抗体效价可达1:40 000;免疫组织化学检测显示在A-375和SGC-7901肿瘤组织的胞浆内出现团块状棕黄色颗粒样沉淀,而在BGC-823肿瘤组织中呈阴性,表明制备的MAGE-A3兔多克隆抗体能够特异性地识别肿瘤组织中MAGE-A3蛋白。结论:通过原核表达系统制备了MAGE-A3蛋白,并免疫兔制备了MAGE-A3蛋白特异性兔多克隆抗体,同时可以特异性地识别人胃癌细胞中的MAGE-A3蛋白,可作为免疫诊断用抗原。

小鼠PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的原核表达及亲和性

目的:制备小鼠PD-1胞外区(mPD-1)与其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法:通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核表达系统制备相应的重组蛋白并纯化,通过Western blot进行鉴定;将纯化的mPD-L1蛋白免疫健康日本大耳白兔制备兔多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot分析得到的多克隆抗体的效价和特异性,并且将该多克隆抗体作为免疫荧光的阳性对照。最后应用ELISA和免疫荧光验证mPD-1与其配体mPD-L1蛋白的亲和性。结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示原核表达的重组蛋白与预期大小一致,mPD-L1和mPD-1分别为25 kDa和40 kDa。经mPD-L1蛋白免疫后的日本大耳白兔能够产生特异性抗体,抗体效价在免疫后第6周达到高峰,Western blot检测结果显示多克隆血清可特异性识别mPD-1。ELISA结果表明,原核表达的mPD-L1蛋白能够和mPD-1蛋白结合,实验组OD450值明显高于对照组。免疫荧光结果显示,在小鼠PD-L1阳性细胞B16(小鼠黑色素瘤细胞株)的胞膜区出现绿色荧光团块。结论:利用原核细胞表达并纯化后获得mPD-L1和mPD-1蛋白,并在体外成功验证了mPD-L1和mPD-1之间的结合特性,为后期利用mPD-1和PD-L1的生物学特性研究提供了基础。

M13噬菌体多克隆抗体的制备与鉴定

目的 :制备M13K07辅助噬菌体多克隆抗体。方法:将M13K07辅助噬菌体进行大量扩增,以此作为免疫原于1、3、5周进行兔免疫,收集0周和免疫后2、4、6、8周免疫血清,用间接ELISA法对兔免疫血清的效价进行检测,进一步用免疫斑点实验检测兔多克隆抗体与M13K07辅助噬菌体的特异性结合能力。结果:M13K07辅助噬菌体免疫兔可产生高效价的多克隆抗体,效价达1:3 200,并能特异性识别M13K07辅助噬菌体。结论:成功制备了高效价的M13K07辅助噬菌体多克隆抗体,为噬菌体展示技术研究提供了检测抗体。

EB病毒潜伏膜蛋白2B表位特异性兔血清抗体的制备和鉴定

目的制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体。方法利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并经BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆至pET32a(+)载体,测序鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基硫代-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。用镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化表达产物,与佐剂乳化后皮下多点注射日本大耳白兔,隔周免疫1次,共3次。分别于免疫的0、2、4、6、8周取血,采用ELISA方法检测IgG抗体水平,采用Western blot和细胞免疫荧光法检测兔血清抗体的免疫反应性和结合特异性。结果 EBV LMP2B表位重组蛋白可通过原核表达系统进行表达,纯化的表达蛋白免疫兔可产生特异性IgG抗体,效价达1∶30 000。经Western blot法和细胞免疫荧光法鉴定,制备的兔血清抗体可识别LMP2重组蛋白和LMP2天然蛋白。结论成功获得了EBV LMP2串联B表位重组蛋白,制备的兔多克隆血清抗体效价高,特异性强,为LMP2的生物学和免疫学研究奠定了基础。

启动子高甲基化抑制趋化因子CXC趋化因子配体14在胃癌组织中的表达

CXC趋化因子配体14（CXCL14）作为趋化凶子CXC子家族的一员，普遍存在于人体正常组织，有提供维持机体稳态的作用，但在各类实体肿瘤中表达高低不。本研究旨在观察CXCL14在胃癌中的表达，并探讨其机制。

HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位预测及分析

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨膜趋势及其亲水性,表面可及性,抗原性,极性和柔韧性等特性。综合以上参数预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位,并进一步进行同源性匹配分析。结果综合多个参数分析显示B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、30-36、45-49、105-109、119-125和148-158区段及其附近,进一步同源性匹配分析支持其中区段2-7、9-19、119-125及148-158为可能的B细胞线性表位,其中区段148-158(RSSRTRRETQL)为HPV16型E6蛋白所特有的序列,而区段2-7(HQKRTA)、9-19(FQDPQERPRKL)与HPV9型E6蛋白具有同源性,区段119-125(PEEKQRH)与HPV31型E6蛋白具有同源性。结论综合分析预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、119-125及148-158区段,为HPV16型E6蛋白的进一步研究奠定了基础。

E型沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备E型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)多克隆抗体,并在体外检测其生物学特性。方法通过分子克隆方法构建重组表达质粒pET21a(+)/MOMP,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组MOMP蛋白,经镍螯合亲和层析胶纯化后,经皮下多点注射免疫日本大耳白兔,制备兔多克隆抗体,分别采用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。在HeLa细胞中培养E血清型Ct,通过卢戈和吉姆萨染色法观察细胞中Ct包涵体的形成情况,间接免疫荧光法检测制备的MOMP多克隆抗体对Ct天然MOMP的结合特异性。结果Ct MOMP可在原核表达系统中高效表达;制备的兔抗MOMP多克隆抗体ELISA效价可达1∶256000,可特异性结合、识别融合及天然的Ct MOMP。结论制备的兔抗Ct MOMP多克隆抗体效价高、特异性强,为后续进一步研究Ct的致病机制及开发新的免疫诊断制剂奠定了基础。