重症急性呼吸道感染患儿中人鼻病毒分型检测及流行病学分析

目的:调查重症急性呼吸道感染患儿中人鼻病毒(HRV)的感染情况,初步了解不同型别HRV流行病学和临床特点。方法:收集2008年5月至2010年3月北京儿童医院重症急性呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物样本259份,采用巢式PCR法,先用鼻病毒5′UTR引物筛查样本中该病毒总的感染情况,再用针对VP4-VP2区域的引物对阳性样本进行分型检测;同时对阳性样本进行其他常见呼吸道病毒共感染检测与流行病学及临床特点分析。结果:259例样本中,5′UTR初筛HRV阳性89例(34.4%),与其他常见呼吸道病毒存在共感染54例(60.7%);可通过VP4-VP2分型测序确定39例HRV-A(48.1%)、4例HRV-B(4.9%)、38例HRV-C(46.9%);HRV-A感染率最高的季节分布是秋季;HRV-A和HRV-C型感染者在临床特点上无明显差别。结论:HRV是儿童重症急性呼吸道感染的重要病原之一,新发现的HRV-C基因型感染率与HRV-A相似,但HRV在儿童重症急性呼吸道感染中的病原学意义还须进一步确认。

中东呼吸综合征冠状病毒基因组结构特征和分子检测研究进展

中东呼吸综合征冠状病毒是新近确定的新型冠状病毒，致病性强、病死率高，是p冠状病毒的C组中可感染人的病毒。该病毒基因组结构与其他已知人类冠状病毒基因组结构相似。至今已经发现该病毒具有不同亚型。但是对于该病毒溯源不是十分清楚，有证据指向可能来源于蝙蝠或单峰驼。一系列针对该病毒的分子检测方法已建立并应用于实验室与临床。

重症急性呼吸道感染儿童中人腺病毒感染的型别分布及其流行病学特征

腺病毒是Rowe等于1953年在人的腺样组织中被发现，并因此而得名。人腺病毒感染在全球范围广泛流行，可引起多种疾病。其分型检测主要方法是PCR结合测序。国内外关于婴幼儿急性呼吸道感染中腺病毒的检测及临床特征的分析已有不少报道，但多数研究不进行具体分型分析，且对于近年来我国严重急性呼吸道感染（severe acute respiratory infection, SARI）住院儿童中人腺病毒的分型分布及相关流行病学特点的研究较少。为此，本研究对来自北京某儿童医院内SARI住院儿童鼻咽抽吸物进行人腺病毒的分型检测与分析。

北京、上海严重急性呼吸道感染儿童中肠道病毒D68的检出与基因特征分析

为了解肠病毒D68（EV-D68）在北京、上海地区严重急性呼吸道感染（SARI）儿童中的流行情况和分子特征。本研究采集2008～2010年北京儿童医院SARI儿童呼吸道样品259份,2013～2014年上海复旦大学附属儿科医院SARI儿童呼吸道样品441份,采用套式RT-PCR结合测序方法检测筛选EV-D68阳性样品,设计EV-D68全基因组通用引物,对EV-D68阳性样品进行全基因组扩增,收集NCBI核酸数据库中目前所有的EV-D68全基因组序列进行序列分析,比较EV-D68中国和美国流行株的差异。结果发现：北京地区检测EV-D68阳性样品1例,阳性率为0.4%,上海地区检测EV-D68阳性样品4例,阳性率为0.9%。结合目前中国已上传的所有EV-D68相关序列,分析表明：目前中国地区流行的EV-D68主要属于Clade A2或Clade B2亚型,不同于美国的Clade A1、Clade B1、Clade B4和Clade B5亚型,另外EV-D68部分基因进化分析时出现树形结构冲突现象;上述结果表明目前EVD68在北京、上海地区的SARI儿童群体中的感染率较低（5/700;〈1%）;中国与美国流行的EV-D68毒株属于不同的分支,差异较大,部分序列分析表明EV-D68病毒可能存在组内重组现象。

浙南地区重症肺炎住院儿童中常见呼吸道病毒感染的检测分析

目的了解重症社区获得性肺炎（CAP）儿童中常见呼吸道病毒感染情况及人腺病毒（HAdV）感染的分子型别与临床特征。方法收集浙南地区293份住院重症CAP儿童的痰吸液,使用PCR方法,进行16种呼吸道病毒检测,并对其中人腺病毒阳性样本进行分型分析与临床特征分析。结果常见呼吸道病毒检出率为92.8%（272/293）,其中以呼吸道合胞病毒（RSV）（37.2%,109/293）、人博卡病毒（HBoV）（22.5%,66/293）、人鼻病毒（HRV）（17.1%,50/293）等检出率较高。人腺病毒共检出24份（8.2%,95%CI4.9%～11.5%）阳性,以2岁以下儿童易感。人腺病毒阳性样本中,C组占83.3%（20/24;HAdV-2：8例,HAdV-5：6例,HAdV-1：5例,HAdV-6：1例）,B组占12.5%（3/24;HAdV-3：2例,HAdV-7：1例）,E组（HAdV-4）1份。临床症状除咳嗽外其余在HAdV感染者与非感染者中差异均无统计学意义。结论浙南地区重症社区获得性肺炎住院儿童痰吸液样本中常见呼吸道病毒感染检出率较高,人腺病毒也是较常见的病原体,且以C组中的1、2、5型最为常见。

重症急性呼吸道感染儿童中人博卡病毒的分型检测与基因进化分析

目的 了解重症急性呼吸道感染住院儿童中人博卡病毒（HBoV）的感染状况,流行病学特征及其进化特征.方法 采用巢式PCR的方法,对来自北京儿童医院重症急性呼吸道感染住院儿童的259份鼻咽抽吸物,进行人博卡病毒（HBoV）分型检测与测序,同时进行了合并感染检测、流行病学、临床特点及基因多态性分析.结果 共检出56份人博卡病毒感染阳性标本,阳性率为21.6％,[95％ CI（16.0％～27.3％）,P＜0.0001],其中2岁以下儿童感染率较高.与其他呼吸道常见病毒的合并感染率为94.6％.HBoV阳性产物测序分析发现,人博卡病毒1型占96.4％ （54/56）,2、3型各1份.HBoV阳性株分型区（VP1/VP2）序列变异不明显.结论 人博卡病毒是儿童急性呼吸道感染常见的病原体,以I型最为常见,分型区（VP1/VP2）序列较保守.HBoV在重症急性呼吸道感染儿童中是否起到真正的致病作用还需进一步的研究.

病毒分离培养新技术及其应用

一些新发病毒和难培养病毒,如人冠状病毒、人诺如病毒、肝炎病毒等,由于缺乏有效培养体系,使这些病毒的疫苗研发、病理机制等深入研究受限。本文总结了传统病毒培养分离技术的发展及其应用,重点介绍了近年来发展的一些新兴技术,如离心培养、混合细胞培养、转基因培养、器官型上皮细胞"木筏式"培养、基质培养模型、旋转壁式生物反应器培养模型、干细胞来源的细胞培养。这些新技术提高了病毒分离培养效率及灵敏度,促进新病毒的发现,为抗病毒药物、疫苗研发奠定物质基础。

西藏藏族人群中细小病毒B19基因与内地汉族人群的差异

目的 分析人细小病毒B19及人细小病毒4（PARV4）在西藏藏族人群中与内地汉族人群中的基因特点.方法 采用建立的B19与PARV4 PCR筛查方法,分别从西藏藏族人群中与内地汉族人群血液标本中获得人细小病毒B19及PARV4的部分基因片段,经纯化、测序后,进行基因进化树分析.结果 共获得10个B19 VP1基因片段序列（西藏,2个;四川,3个;浙江,5个）;10个PAV4ORF1基因片段序列（西藏,2个;四川,2个;云南,1个;浙江,5个）;西藏藏族人群中细小病毒B19基因与内地汉族人群同属基因1A亚型,但为不同进化分支;而西藏藏族与内地汉族人群PAV4基因属同一分支.结论 细小病毒B19基因在西藏藏族与内地汉族人群中的差异分析为该病的检测与控制提供了参考.

高致病性人禽流感 H5N1病毒 HA 与 M1蛋白共表达制备新型病毒样颗粒

目的：制备由H5N1亚型人禽流感病毒血凝素（HA）和基质蛋白1（M1）两种结构蛋白组装而成的H5亚型流感病毒样颗粒（ viruslike particles，VLPs）并检测其生物活性。方法构建同时包含 A／Indonesia／05／2005（ H5N1） HA 和 A／Anhui／01／2005（ H5N1） M1基因的重组转移载体pFBD-M1-HA，筛选获得重组杆粒（重组杆状病毒质粒） rBacmid-M1-HA后，转染Spodoptra frugiperda （Sf9）昆虫细胞，包装重组杆状病毒rBV-M1-HA；Western blot和间接免疫荧光鉴定HA和M1的表达；大量制备并纯化后，在透射电镜下观察VLPs的形态结构；血凝试验检测VLPs的生物活性。结果应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达H5N1 HA和M1两种结构蛋白可以高效组装产生流感VLPs，纯化后的VLPs血凝效价为1024 HAU／50μl。结论成功利用A／Indonesia／05／2005（H5N1）来源HA和A／Anhui／01／2005（H5N1）来源M1两种结构蛋白，在杆状病毒表达系统中制备有较好生物活性的人禽流感病毒H5亚型VLPs，为下一步研究人H5亚型禽流感VLPs疫苗奠定基础。