目的建立检测棘阿米巴18srDNA的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time PCR or qPCR)方法,为无创早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法。方法提取分离自土壤和水中的5株棘阿米巴DNA,测序后与GenBank中搜索到的棘阿米巴67条序列进行比...目的建立检测棘阿米巴18srDNA的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time PCR or qPCR)方法,为无创早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法。方法提取分离自土壤和水中的5株棘阿米巴DNA,测序后与GenBank中搜索到的棘阿米巴67条序列进行比对,在物种保守区域设计Real-time引物和TaqMan探针,通过T克隆载体制作标准品并测序,建立方法的标准曲线,测定最低检测浓度,同时用该方法检测其他病原微生物及临床疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,实验数据通过JMP5.0.1和测评软件进行棘阿米巴角膜炎F检验和诊断测试评估。结果qPCR和培养法检测180例疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,阳性率分别为(5±1)%和(2.9±1.2)%,差异有统计学意义(F=13,P<0.01)。以qPCR法测定的标准品CT值为纵坐标(Y),以标本浓度的对数为横坐标(X)建立标准曲线:Y=-3.24X+40.74,R>0.99。用建立的qPCR方法测定棘阿米巴18srDNA最低浓度为10拷贝/UL。用qPCR检测其他病原微生物,结果均为阴性。通过诊断测试评估软件比较两种方法检测临床疑似病人眼分泌物结果,95%置信区间内qPCR方法的灵敏度为100%,传统实验室培养法为62.5%。结论棘阿米巴18srDNA Real-time PCR基因检测方法具有无创伤性、高效、特异、经济等特点,适用于疑似棘阿米巴角膜炎病人的筛查。展开更多
