HPV16 E5多表位肽免疫原性研究

目的筛选人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白多表位肽段,并评估其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的免疫原性反应。方法通过Uniprot获得HPV16 E5蛋白的氨基酸序列,采用EXPASY和SYFPEITHI等软件预测HPV16 E5蛋白的表位,筛选出富含B细胞和CTL表位的氨基酸肽段——HPV16 E5蛋白N端处aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV),进一步用该多表位肽免疫C57BL/6小鼠,评估其诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫的反应。结果该肽段可诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,且抗体滴度随着免疫次数增加而升高,同时可诱导小鼠产生特异性的CTL反应,在效靶比为40∶1时,对靶细胞产生显著的特异性杀伤作用。结论HPV16 E5蛋白多表位肽aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV)具有良好的免疫原性,可为基于HPV16 E5蛋白的疫苗研究提供基础。

人巨细胞病毒UL138基因表达对胃癌细胞免疫相关功能的影响

目的:探讨人巨细胞病毒UL138基因表达对胃癌细胞免疫相关功能的影响。方法:构建UL138基因真核表达重组质粒,转染BGC-823胃癌细胞,经Westernblot及免疫荧光验证UL138表达,通过基因芯片结合生物信息学技术分析UL138表达对胃癌细胞功能的影响,荧光定量PCR进一步验证胃癌细胞中免疫相关分子的表达,Westernblot分析免疫原性死亡相关蛋白的变化。结果:Westernblot及免疫荧光证实重组质粒转染后胃癌细胞表达UL138;基因芯片差异基因分析显示UL138的表达上调了370个基因表达,下调了206个基因的表达;生物信息学分析提示这些差异基因的表达参与了胃癌细胞骨架重构、细胞黏附等并与消化系统疾病相关。荧光定量PCR分析显示UL138的表达上调了IL1A、IL6、IL11、IL8、IL1RL1、IL7R、IL13RA2、CCL3L1、CCL5、TNFAIP3、TNFRSF21、VEGFA、CD44、CD55、CD59、CD27416种炎症相关细胞因子基因表达并下调了CXCL10、IFNAR1基因的表达。此外,Westernblot结果显示UL138的表达上调了免疫原性死亡相关蛋白ERp57的表达(P<0.01),不影响HSP70的表达(P>0.05)。结论:UL138基因的表达能促进胃癌细胞促炎相关细胞因子表达并诱导免疫原性细胞死亡的特征。

新型冠状病毒S蛋白B细胞表位的预测与分析

目的:分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S刺突蛋白的二级结构并预测其可能的B细胞表位。方法:基于SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列,分别采用SOPMA、GOR方法预测S蛋白的二级结构,并结合其跨膜区、亲水性、表面可及性和抗原性参数等综合分析,预测SARS-CoV-2 S蛋白可能的B细胞表位。结果:对SARS-CoV-2 S蛋白二级结构的预测表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。多种参数综合分析推测,其可能的优势B细胞表位位于354~360、437~445、454~471、527~537、567~582、678~685、772~779和806~818位氨基酸。结论:采用多参数预测SARS-CoV-2 S蛋白的B细胞表位,为深入研究S蛋白的功能奠定基础。

诱导性表达人巨细胞病毒UL138蛋白的胃癌细胞株构建及其效应评价

目的:构建可诱导表达人巨细胞病毒(HCMV)UL138蛋白的稳定遗传胃癌细胞系,并评价UL138对胃癌细胞的生物学效应。方法:将p CMV-tet3G质粒转染BGC-823胃癌细胞,通过G418及荧光素酶活性检测筛选BGCTet-on细胞株。再将含有UL138外源基因的p TRE3G-UL138质粒转染稳定BGCTet-on细胞株,通过G418及潮霉素双抗筛选,获得诱导性表达UL138基因的胃癌细胞(BGC-UL138_(Tet-on))。强力霉素(DOX)诱导后,采用Western blot验证UL138蛋白表达,采用流式细胞术及CCK8试剂盒检测UL138蛋白表达对胃癌细胞的生长周期及增殖的影响。构建荷瘤裸鼠模型,体内验证UL138蛋白表达对胃癌细胞增殖的影响。结果:成功构建了DOX诱导性表达的、携带UL138基因的BGC-UL138_(Tet-on)稳转细胞株。UL138蛋白表达可显著抑制胃癌细胞增殖;流式细胞术检测显示UL138蛋白表达阻滞BGC-823细胞周期在G_1期。荷瘤裸鼠模型体内实验发现,DOX腹腔注射诱导UL138蛋白表达后,BGC-UL138_(Tet-on)移植瘤体积缩小甚至消失。结论:成功构建可诱导表达UL138蛋白的胃癌细胞株,进一步证实HCMV基因UL138的表达可在体内和体外抑制胃癌细胞的增殖,细胞实验提示细胞周期阻断在G_1期。

人巨细胞病毒US31基因序列特征分析及B细胞表位预测

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）US31基因序列，预测US31基因编码蛋白的B细胞优势表位。方法：基于US31基因编码蛋白的氨基酸序列，结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVUS31基因编码各型蛋白的B细胞表位进行预测，参照已建立的预测方法综合评价US31基因B细胞优势表位。结果：US31核苷酸序列变异较少，大部分是同义突变，氨基酸序列高度保守；其编码蛋白全长为162个氨基酸，相对分子质量20kD，等电点7.66，为可溶性蛋白，二级结构中以无规则卷曲为主。经综合分析，US31基因的B细胞优势表位可能存在于氨基酸序列N端的5～19、32～47、58～68、110～124区段。结论：多参数预测HCMVpUS31的B细胞优势表位，为进一步研究蛋白特征、制备单克隆抗体及表位疫苗提供依据。

甲基转移酶样因子3在结肠癌中高表达并促进结肠癌细胞恶性表型

目的:研究甲基转移酶样因子3(METTL3)在结肠癌患者中的表达特征及其与临床预后相关性,并探讨METTL3表达对结肠癌细胞不同生物学表型的影响。方法:综合分析癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库和4个不同来源的基因表达数据库(GEO)数据集中1278例结肠癌组织和41例癌旁组织中METTL3基因的表达差异;使用Kaplan-Meier曲线分析METTL3表达高低对患者预后的影响。回顾性收集2014—2018年温州医科大学附属第一医院行根治性手术的481例结肠癌组织和59例癌旁组织,使用免疫组化法检测METTL3蛋白的表达差异。采用小干扰RNA(siRNA)分别敲低结肠癌细胞系DLD-1和HCT-116中METTL3的表达水平;采用CCK-8法和Transwell法检测METTL3表达对结肠癌细胞系不同恶性表型的影响。结果:在TCGA数据库和本中心结肠癌组织标本中,METTL3在肠癌组织中的表达均升高(P<0.001)。生存分析结果显示,METTL3高表达与结肠癌患者较短的总生存期(Log-rank P=0.028)和无病生存期(Log-rank P=0.035)相关。单因素和多因素Cox分析结果显示,METTL3可以作为结肠癌患者预后的独立危险因素(HR=1.335,95%CI=1.032~1.738,P=0.030)。同时,敲低METTL3的表达可以显著抑制结肠癌细胞DLD-1和HCT-116的增殖(P<0.01)和迁移侵袭能力(P<0.01)。结论:METTL3在结肠癌组织中表达上调,并可以作为结肠癌患者不良预后的独立因素。敲低METTL3表达可以抑制结肠癌细胞恶性表型。METTL3可能作为致癌基因参与结肠癌恶性进展。

microRNA-466在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达及其意义

目的:分析微RNA-466(microRNA-466,miR-466)在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)及正常宫颈的表达情况及其与临床病理之间的关系。方法:采用茎环RT-qPCR分析23例宫颈癌、47例CIN,以及13例正常宫颈组织中miR-466的表达,并分析其表达与宫颈癌常见的临床病理特征间的关系。结果:茎环RT-PCR方法能特异检测miR-466;荧光定量PCR分析示miR-466在宫颈癌中的表达低于CIN及正常宫颈组织(P<0.05);正常宫颈与CIN之间比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-466的表达与年龄、肿块大小、大体类型及组织分化程度差异无统计学意义(P>0.05);miRNA-466与预测的HPV特异性miRNA同源性分析提示,miR-466与HPV16、18的长控制区(LCR)序列高度同源;生物信息学分析提示,miR-466可调控多种靶基因。结论:miR-466在宫颈癌、CIN及正常宫颈中表达存在明显差异,其在正常宫颈及CIN中相对表达量明显高于宫颈癌;miR-466的异常表达,可能与HPV的LCR区高度同源性相关;miR-466可能调控多种靶分子,参与宫颈癌发生发展过程。

程序性死亡受体配体-1 B细胞表位预测与分析

目的:预测和筛选程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的B细胞表位,以期用于能够阻断程序性死亡受体(PD-1)和其配体结合的拮抗剂的研究。方法:以人和小鼠的PD-L1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学方法,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案等,结合PD-L1的二级结构与其柔性区域对PD-L1的优势B细胞表位区段进行综合分析,建立3D模型,结合功能定位,进一步运用抗原指数分析预测,将人与小鼠的B细胞表位进行对比分析,并与多种实验动物进行同源性分析。结果:人和小鼠的PD-L1均为一型跨膜蛋白,均由290个氨基酸残基组成,相对分子质量均为33 kDa。人和小鼠PD-L1的胞外段分别位于N端的19~238和19~239。经综合分析,与PD-1、PDL1结合相关的人和小鼠的B细胞优势表位可能分别位于其氨基酸序列N端的41~46、60~63、71~75和40~48、58~63、72~88区段,即KFPVEK、EDKN、EEDLK和RFPVERELDL、EKEDE、EDLKPQH肽段;同源性分析显示包含本研究所预测的表位的氨基酸序列在多种动物之间高度保守。结论:将生物信息学预测B细胞表位的方法与3D模型建立及功能定位的方法相结合,筛选出人和鼠各3条与PD-L1功能区相近的优势B表位,为阻断PD-1和PD-L1结合的拮抗剂的研究提供了理论基础。

PD-L2蛋白B细胞表位预测及其与PD-1结合的三维结构分析

目的:对人源程序性死亡因子1配体2(PD-L2)的B细胞表位进行预测及其与PD-1结合的三维结构分析。方法:采用生物信息学分析软件及服务器上的在线分析系统预测人类PD-L2蛋白的二级结构,柔性区域,Hopp&Woods亲水性、Zimmerman极性参数和Jameson-Wolf抗原指数以及Emini表面可及性方案等,预测结果被用以对PD-L2的优势B细胞表位区段进行多方面分析。运用抗原指数分析,预测PD-L2的B细胞表位。使用BLAST分析人源PD-L2与小鼠PD-L2的同源性,将人源PD-L2的B表位与小鼠PD-L2的序列进行匹配。将与人源PD-L2表位匹配的序列在小鼠PD-1与小鼠PD-L2的结合模型上定位,对其立体结构进行模拟,进一步直观地分析B细胞表位与蛋白结合位点的关系。结果:PD-L2的全长氨基酸序列共含有273个氨基酸,相对分子质量为31 k Da的可溶性蛋白;经综合分析,其B细胞优势表位可能为氨基酸序列N端的60~72、93~97、133~139、164~171区段。模拟立体结构分析显示表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PDL2的结合区域内。结论:利用生物信息学预测发现PD-L2的优势B细胞表位中,60~72、93~97、133~139、164~171区段为PD-L2的B细胞表位,其中表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PD-L2的结合区域内。可为PD-L2抗体设计和研究提供理论基础。

宫颈癌组织HPV16早期基因E6相关转录本检测方法的建立及意义

目的:建立宫颈癌组织HPV16早期基因E6相关转录本检测方法,分析宫颈癌发生各时期的HPV16早期基因E6相关转录的情况。方法:留取HPV16阳性的宫颈肿瘤组织63例,包括8例低度鳞状上皮内瘤变(LSIL)、38例高度鳞状上皮内瘤变(HSIL)和17例宫颈癌,提取RNA,利用含保守序列的RT引物将标本中的mRNA反转录成5’端含保守序列的cDNA,并利用HPV16 E6特异性引物(P1)和保守序列(P0)进行PCR扩增,建立特异性扩增HPV16 E6相关转录本的方法,检测标本中HPV16 E6相关的转录本,通过E6特异性探针进行Southern杂交加以验证。结果:成功建立了HPV16 E6相关转录模式分析的方法。经分析HPV16阳性的LSIL、HSIL及宫颈癌组织中E6转录模式结果发现,不同级别HPV16阳性的宫颈肿瘤组织的转录模式差异显著。随着LSIL向宫颈癌发展,肿瘤组织中HPV16 E6转录本种类增多,且优势转录模式逐渐清晰。结论:成功建立HPV16 E6相关转录模式分析的方法,并发现HPV16早期基因E6相关的转录模式与宫颈肿瘤癌变程度密切相关,其可能参与宫颈癌的发生和发展。

DAXX在胃癌中的表达定位及其小泛素化修饰对胃癌恶性表型的影响

目的:研究死亡结构域相关蛋白(DAXX)在胃癌中的表达与定位,并探讨小泛素化修饰(SUMO)的DAXX对胃癌细胞恶性表型的影响。方法:生物信息学分析肿瘤基因图谱(TCGA)计划中DAXX在胃癌中的表达与预后;RT-qPCR检测各胃癌细胞系中DAXX的mRNA水平。收集2017年1月至6月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院胃癌术后患者20对癌和癌旁组织,免疫组化检测DAXX的表达。CCK-8和划痕实验分别检测DAXX对细胞增殖和迁移的作用。Western blot检测DAXX的核-浆蛋白分布及其对SUMO-2/3的影响。结果:生物信息学分析显示,DAXX在胃癌中的表达水平高于癌旁组织,但其表达高低对患者生存预后无影响(P=0.52);免疫组化结果显示胃癌组织DAXX的阳性率高于癌旁,且在细胞核中高表达;RT-qPCR证实胃癌细胞系中DAXX的mRNA表达量升高。CCK-8和划痕实验提示DAXX明显抑制细胞增殖(P<0.05)并促进细胞迁移(P<0.01)。Western blot显示DAXX核-浆蛋白分布差异,且存在SUMO-2/3修饰。结论:DAXX在胃癌组织中高表达,且主要定位于细胞核。DAXX可能通过与SUMO-2/3结合,抑制胃癌增殖和促进转移。

宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型检测方法的建立及应用

[目的]建立一种新型宫颈肿瘤组织高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及分型方法,并评价其临床应用。[方法]基于我国人群流行的5种高危型HPV(HPV 16、18、31、33、51)的E6/E7早期基因序列,设计特异性引物,以明确HPV型别的宫颈癌细胞株及宫颈肿瘤组织为模板,进行PCR检测,结合基因测序验证引物的特异性。进一步优化条件,建立高危型HPV多重PCR检测方法,检测65例宫颈肿瘤组织标本,与临床上使用的流式荧光杂交HPV检测法比较,评价其敏感性和特异性。[结果]成功建立可同时检测5种高危型HPV的多重PCR检测方法,对65例宫颈肿瘤组织进行高危型HPV检测,检出率为72.3%,明显高于临床流式荧光杂交检测法的检出率(32.31%)(χ2=3.86,P<0.05)。[结论 ]基于HPV E6/E7早期基因的高危型HPV多重PCR检测方法是特异、灵敏的高危型HPV检测方法。