基于PCR Array技术探讨健脾化瘀祛痰方对动脉粥样硬化家兔主动脉线粒体能量代谢相关基因mRNA表达的影响

目的采用PCR Array技术检测健脾化瘀祛痰方对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)家兔主动脉线粒体能量代谢相关基因mRNA表达的影响,从线粒体能量角度初探健脾化瘀祛痰方防治AS的潜在靶点。方法将45只新西兰家兔随机分为对照组、模型组和中药组,每组15只。对照组喂饲普通饲料;模型组和中药组给予免疫性内皮损伤合并高脂饲料喂饲干预8周,制备家兔AS模型;造模成功后,中药组给予健脾化瘀祛痰方,对照组及模型组给予同等体积生理盐水,灌胃给药,每日1次,给药4周后取材。采用全自动生化分析仪检测各组家兔血脂水平;油红O染色和天狼星红染色观察主动脉斑块脂质沉积和血管胶原成分;PCR Array技术检测主动脉线粒体能量代谢相关基因的mRNA表达。结果血脂结果显示,与对照组比较,模型组血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高,高密度脂蛋白(HDL)水平降低;与模型组比较,中药组血脂水平均有所改善。油红O染色可见,对照组动脉管壁未见脂质形成;模型组动脉管壁动脉粥样硬化区域可见大面积红色脂滴阳性染色;中药组鲜红色脂质沉积区域明显减少。天狼星染色结果显示,对照组家兔主动脉血管内胶原分布致密、均匀、排列整齐,呈红色;模型组家兔主动脉血管胶原成分减少,呈疏松网状分布,且有部分断裂;中药组家兔主动脉血管胶原分布较规则,胶原之间的腔隙较少,血管结构部分发生改变。PCR Array结果显示中药组与模型组相比下调≥4倍的基因有ARRDC3、ATP5C1、COX4I1LOC100343255、NDUFA6、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFV2、SDHB、SDHC、SDHD、SLC25A25、UQCRQ等21个基因。结论健脾化瘀祛痰方可改善AS家兔主动脉线粒体能量代谢相关基因mRNA的表达,这可能是其降低AS家兔血脂含量,减少主动脉斑块沉积的潜在机制之一。

表达呼吸道合胞病毒G蛋白胞外区的重组H1N1流感病毒单剂滴鼻免疫可在小鼠诱导强免疫应答与保护

目的基于重组流感病毒载体的呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的构建及在小鼠体内的免疫保护效果评价。方法构建并拯救表达RSV A2型G蛋白胞外结构域(Gecto)的重组甲型流感病毒,将其命名为PR8NAGecto/WSN。体外验证重组病毒G蛋白表达与病毒生长动力学后,单剂滴鼻免疫BALB/c小鼠,并评价体液免疫、黏膜免疫与细胞免疫。免疫4周后,分别用RSV A2与RSV B9320进行攻毒,通过小鼠体重变化、肺组织病毒滴度及病理评价免疫保护效果。结果单剂滴鼻免疫PR8NAGecto/WSN能在小鼠体内产生较强的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫。与对照组比较,免疫组小鼠经RSV A2或B9320两个亚型病毒攻毒后肺病毒载量与肺组织病理均明显改善。结论单剂滴鼻免疫重组PR8NAGecto/WSN疫苗可在小鼠体内诱导较强的RSV特异免疫应答与攻毒保护。本研究为新型RSV黏膜疫苗的研发提供新的思路与实验资料。

猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白的表达纯化及其在痘苗病毒免疫血清检测中的应用分析

目的表达纯化猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原蛋白并分析三种蛋白在痘苗病毒免疫血清检测中的应用。方法将猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原按照人源密码子优化合成后插入pVRC载体,转染HEK293T细胞后收获上清,通过Western blot方法验证蛋白表达,通过镍柱和离子交换层析柱纯化蛋白,并采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。分别以纯化A29L、B6R与M1R作为包被抗原,通过ELISA检测痘苗病毒免疫后的小鼠、恒河猴与人血清中IgG抗体滴度,并分析它们与血清中抗痘苗病毒、抗猴痘病毒中和抗体滴度的相关性。结果猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白在细胞上清中均可大量分泌表达。经镍柱及离子交换层析柱进行蛋白纯化后,纯度均可达90%以上。痘苗病毒免疫的动物与人血清中均可检出针对三种蛋白特异的IgG抗体,三个抗原检测的IgG滴度显著相关,痘苗免疫血清中A29L、B6R、M1R特异的IgG与抗痘苗病毒中和抗体水平也显著相关,但与抗猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。结论在痘苗病毒免疫血清中可检测到与猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白交叉反应的IgG抗体,且IgG滴度与抗痘苗病毒中和抗体水平显著相关,但与猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。该研究可为正痘(包括猴痘)病毒免疫学检测方法的应用及疫苗研发提供参考。

基于受体结合区(RBD)的ELISA在MERS-CoV抗体检测中的应用评价

目的比较中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)不同形式受体结合区(receptor binding domain,RBD)蛋白在抗体检测中的应用特点.方法以293T和ExpiCHO-STM系统表达并纯化制备MERS-CoV RBD,采用非变性凝胶电泳和Western blot对纯化RBD蛋白进行鉴定.然后以等量的上述RBD蛋白或昆虫细胞表达的RBD作为包被抗原,建立间接酶联免疫检测方法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA),用于MERS-CoV IgG抗体检测.同时以商品化的欧蒙MERS-CoV IgG抗体检测试剂盒(以S1为包被抗原)为对照,利用WHO提供的MERS-CoV抗体参比品对基于不同RBD蛋白抗原的ELISA方法进行应用效果比较分析.结果采用293T和ExpiCHO-STM系统成功制备MERS-CoV RBD单体/聚体抗原;不同来源与形式的RBD抗原均能特异识别MERS-CoV特异抗体,与正常成人血清无交叉反应;基于RBD所建立的ELISA应用于MERS-CoV抗体参比品检测,与欧蒙商品化试剂盒检测结果具有较好的一致性,但RBD-T4f、RBD-GCN4聚体RBD检测阳性标本的读值高且较集中,单体/二聚体RBD(昆虫细胞或哺乳动物细胞)阳性标本的读值低且较分散.结论建立了基于MERS-CoV不同单体与聚体RBD蛋白抗原的间接ELISA检测方法,可替代欧蒙商品化试剂盒用于临床检测MERS-CoV特异IgG抗体.RBD-T4f、RBD-GCN4包被抗原的应用结果优于RBD抗原.

两种商品化新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的应用性能评价

目的评价两种商品化新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)中和抗体检测EIA试剂盒的应用性能。方法使用两种商品化SARS-CoV-2中和抗体ELISA检测试剂盒(A和B),以疫苗免疫前血清44例、免疫后1个月血清120例、COVID-19患者愈后6个月的恢复期血清64例作为样本盘,进行中和抗体检测,同时通过活病毒微量中和试验(micro-neutralization test,micro-NT)检测上述血清样本的50%中和抗体滴度(50%neutralization titer,NT50)。分析两种商品化试剂盒与活病毒中和试验在定性及定量结果上的一致性。结果定性结果分析发现,以micro-NT检测结果作为标准,A和B试剂盒的阳性符合率分别为97.40%和100.00%;阴性符合率分别为97.30%和95.95%;约登指数分别为0.95和0.96。定量结果分析发现,对于疫苗免疫后样本,A、B试剂盒与micro-NT检测结果的相关系数分别为0.24(P<0.05)和0.52(P<0.0001);对于恢复期血清样本,A、B试剂盒与micro-NT检测结果相关系数分别为0.81(P<0.0001)和0.89(P<0.0001)。结论A和B两种商品化中和抗体检测试剂盒与micro-NT定性结果具有良好一致性,两种试剂盒对恢复期血清样本的中和抗体滴度检测与micro-NT结果表现出了更强的相关性。

甲型流感病毒核蛋白和基质蛋白2胞外域融合mRNA疫苗在小鼠体内的免疫应答研究

目的:基于脂质多聚复合物(lipopolyplex,LPP)递送平台和保守抗原开发的新型流感病毒mRNA疫苗在小鼠体内的免疫原性评价。方法:将4个拷贝的甲型流感病毒基质蛋白2胞外域(extracellular domain of matrix 2 protein,M2e)与核蛋白(nucleoprotein,NP)编码基因按照真核密码子优化,串联构建融合抗原并体外转录为4M2eNP-mRNA,利用LPP技术平台制备甲型流感病毒mRNA疫苗(LPP-4M2eNP)。转染真核细胞后通过免疫荧光体外验证NP和M2e表达;BALB/c小鼠经肌肉注射10μg、30μg mRNA疫苗,间隔4周加强免疫一次,酶联免疫法检测免疫后血清抗体滴度,免疫斑点法检测细胞免疫应答。结果:间接免疫荧光检测表明4M2eNP-mRNA转染真核细胞后NP和M2e正确表达。单针免疫可明显诱导抗原(NP和M2e)特异性细胞免疫应答,加强免疫后在小鼠中诱发了抗原特异性体液免疫应答呈Th1型偏向;NP细胞免疫应答显著提高,但M2e细胞免疫应答强度无明显改变。结论:本研究制备的LPP-4M2eNP疫苗在小鼠中单针免疫即可诱导较强的细胞免疫应答,加强免疫后可诱导明显的体液和细胞免疫应答,表明该疫苗具有较好的研发和应用前景。

生物能量分析仪在肿瘤细胞生物能量代谢中的应用研究

靶向肿瘤细胞代谢过程中关键调控分子抑制肿瘤细胞生长的研究日益成为热点。目前,研究肿瘤细胞氧化磷酸化和有氧糖酵解主要是应用Clark氧电极法测定细胞氧耗率以及对相关中间代谢物的测定,如乳酸和葡萄糖。但是,这些方法测定的指标相对单一,而且过程繁琐。该文详细介绍了生物能量分析仪在研究肿瘤细胞糖酵解和线粒体氧耗率中的应用,并通过研究肿瘤细胞应用阿霉素及相关药物处理后生物能量代谢的变化,深入探讨了这一方法在研究肿瘤细胞生物能量代谢方面中的优越性。研究结果表明,羰基氰–对–三氟甲氧基本腙(carbonylcyanide p-trifluoro methoxyphenylhydrazone,FCCP)的浓度以及细胞数量对于研究肿瘤细胞的氧耗率十分关键,应用阿霉素能够显著抑制肿瘤细胞的有氧糖酵解和线粒体氧耗率。通过该文的介绍,期望能为肿瘤细胞生物能量代谢研究提供进一步的参考。

西尼罗病毒新型DNA疫苗在小鼠中诱导较强体液与细胞免疫应答

目的评价一种新型西尼罗病毒(WNV)DNA疫苗在小鼠模型中免疫效果。方法首先构建了表达WNV新疆分离株(XJ11129-3)前体膜(prM)和包膜蛋白(E)的DNA疫苗VRC-prME,体外验证其表达并能产生病毒样颗粒,经肌肉注射加电转途径免疫C57BL/6小鼠,间隔4周加强免疫。采用酶联免疫法检测免后血清抗体,WNV(NY99株)单轮感染性颗粒检测中和抗体,免疫斑点法与胞内细胞因子染色检测细胞免疫应答。结果VRC-prME加强免疫2周后诱导小鼠产生了较强的Th1型偏向抗体应答,并能交叉中和WNV(NY99株)的单轮感染性颗粒,该疫苗同时诱导了抗原特异性的多功能CD8^(+)T(IFN-γ、IL-2、TNF-α)细胞应答。结论本研究制备的表达西尼罗病毒新疆分离株前体膜和包膜蛋白的新型DNA疫苗在小鼠中诱导较强的体液免疫和细胞免疫应答,具有较好的研发与应用前景。

mtDNA单倍型D4和B4a细胞线粒体功能及其影响衰老发生的机制研究

该文初步分析了两个与衰老发生抑制及促进的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)单倍型D4和B4a细胞的线粒体功能情况,并对其影响衰老的可能机制进行了探究。通过细胞融合构建两个核背景一致但mtDNA单倍型分别是D4和B4a的胞质杂合细胞。应用RT-PCR方法检测细胞mt DNA拷贝数以及线粒体基因的mRNA水平,氧电极法和非变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native polyacrylamide gelelectrophoresis,BN-PAGE)技术检测细胞线粒体氧化呼吸能力及线粒体复合体水平,TMRM染料和DCFH-DA染料法检测细胞线粒体膜电位和活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成水平。结果显示,D4单倍型细胞线粒体氧呼吸能力、膜电位水平以及线粒体基因(mt-ND1、mt-7S RNA)转录水平均明显高于B4a单倍型细胞,而ROS生成水平明显降低,mt DNA拷贝数则并无明显差异。该结果表明,在D4单倍型细胞中,通过提高某些线粒体基因的表达,使得线粒体呼吸复合体表达得到提升,继而提高线粒体氧化呼吸功能,降低细胞氧化损伤,从而延缓衰老的发生。

环磷酰胺小鼠少精子模型的构建及枸杞煎提液的治疗作用

目的：研究环磷酰胺（CP）小鼠少精子模型的构建方法，以及评价枸杞煎提液对少精子症的治疗作用。方法小鼠分别以60、80、100mg/kg CP腹腔注射，qid，连续5d，测定精子相对数和睾丸组织切片，得出最适CP剂量；再以高低剂量（20g/kg、10g/kg）枸杞煎提液给最适CP剂量构建的少精子小鼠灌胃14d，测定精子相对数、睾丸组织切片和流式细胞仪检测生精细胞倍性。结果3种剂量CP处理组精子相对计数、生精小管面积、直径、生精上皮细胞层数（CMSE）均显著低于空白对照组和生理盐水组（P＜0.001）；枸杞高低剂量组精子相对计数、生精小管面积、直径、CMSE显著高于阳性对照组（P＜0.001）；枸杞高剂量组与阳性对照组比在单倍体细胞（1C细胞）比例上显著降低，四倍体细胞（4C细胞）比例上显著升高（P＜0.05），枸杞低剂量组与阳性对照组比在二倍体细胞（2C细胞）比例上显著升高（P＜0.05）。结论60mg/kg CP为构建小鼠少精子模型的适宜剂量；枸杞煎提液对少精子症有一定治疗效果，可能与促进4C细胞增殖有关。

C.elegans中clk-1基因对寿命的影响

clk-1[clock(biological timing)abnormality-1]是泛醌合成所必需的,参与电子传递过程,从而影响线粒体呼吸功能,其突变是已发现的第一个寿命延长的线粒体基因突变。该文通过对线虫表型、线粒体功能的相关检测来研究clk-1突变和clk-1 RNAi(RNA interference)对线虫寿命的影响。结果表明,clk-1突变线虫MQ130寿命延长,线粒体中活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平升高而胞质中ROS水平下降,总ATP含量升高;clk-1 RNAi线虫寿命缩短,线粒体中ROS水平下降而胞质中ROS水平升高,总ATP含量下降。ROS作为细胞的一种信号分子,与线虫的衰老密切相关;ATP是能量代谢的一个重要指标,其含量的升高代表着能量代谢缓慢。由此可见,clk-1突变线虫和clk-1RNAi线虫寿命的差异可能与线粒体和胞质中ROS的不同功能以及能量代谢速率的不同有关。

376例新冠肺炎恢复期与灭活疫苗接种后人群的血清抗体检测结果分析

目的对愈后半年及灭活疫苗接种后1至9个月人群IgM和IgG抗体应答的特点进行分析。方法以灭活疫苗免疫后1、3、6、9月四个不同月份人群血清共336例,新型冠状病毒肺炎(COVID-19)愈后6个月的恢复期血清40例作为样本盘,分别使用BGI(中国北京)、WANTAI(中国北京)两种商品化SARS-CoV-2 IgM抗体ELISA检测试剂盒以及KEWEI(中国北京)、WANTAI(中国北京)两种IgG抗体ELISA检测试剂盒进行IgM和IgG抗体检测。结果疫苗免疫后1个月IgM抗体阳性率分别为40%(BGI)与23%(WANTAI);在免疫后9个月血清中仍可检出IgM抗体阳性,为2.1%(1/48)。免疫后1个月IgG抗体阳性率均为100%,几何平均滴度(GMT)分别为256.3(KEWEI)与152.4(WANTAI);免疫后6个月IgG抗体阳性率与GMT分别为96.6%、60.25(KEWEI)及85.2%、15.79(WANTAI);灭活疫苗接种后IgG抗体阳性率与GMT均随时间延长呈下降趋势。愈后6个月的恢复期血清IgM与IgG抗体阳性率分别为37.5%与97.5%,IgG抗体GMT为429.6(KEWEI)与121.3(WANTAI)。结论IgM抗体在COVID-19恢复后6个月人群及灭活疫苗接种后9个月人群中均检出,IgM检测阳性作为急性COVID-19感染诊断指标时要审慎解读。灭活疫苗接种后大部分人群IgG抗体阳性率维持时间长于半年,但其滴度低于自然感染后半年人群。