少精子症患者精子鱼精蛋白表达及染色质包装质量

目的:探讨鱼精蛋白(PRM1和PRM2)和精子染色质包装质量对少精子症的影响。方法:参照WHO标准收集了28例少精子症、16例畸形精子症和15例正常对照精液标本。通过提取标本总RNA,经反转录和荧光定量PCR反应分别检测PRM1、PRM2和TRF2mRNA的相对表达量;标本纯化后进行涂片、CMA3染色,通过计算CMA3阳性率检测精子染色质包装质量。结果:少精子症组PRM1和PRM2mRNA相对表达量分别为正常对照组的25%(P<0.05)和20%(P<0.05),畸形精子症组与正常对照组比较差异无统计学意义;TRF2mRNA表达水平3组间差异无统计学意义;少精子症组CMA3阳性率(20.47%±1.19%)是正常对照组(10.69%±1.45%)的191%(P<0.001),畸形精子症组为14.31%±2.01%,与正常对照组比差异无统计学意义。结论:鱼精蛋白(PRM1和PRM2)mRNA表达量减少可能影响精子染色质包装,使得精子形成过程异常,从而导致成熟精子数量减少。

一种检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株的构建

目的:构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株。方法:首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子“外排泵”基因copA的启动子融合构建响应铜离子的CopAp::gfpmut2-pET28a感应元件。然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌(E.coli)MC4100体内负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建。最后优化出最佳检测条件,并将其初步应用于检测水环境中铜离子。结果:相对野生型菌株,E.coliΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突变菌对铜离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05~2.5μmol/L(0.0032~0.16 mg/L)Cu2+;与原子吸收光谱法相比,其对生活饮用水中0.05 mg/L和1 mg/L铜离子的回收率分别为87.90%和104.37%。结论:本研究构建报告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定了技术基础。

真核细胞顺乌头酸酶活性检测新技术——胶内酶活性分析法

顺乌头酸酶(aconitase,Aco)是细胞内重要的铁硫蛋白酶,它催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸.真核细胞中顺乌头酸酶有两种,分别定位在细胞质的顺乌头酸酶1(cAco)和定位在线粒体的顺乌头酸酶2(m-Aco).检测它们活性的变化能敏感地反映出细胞中能量代谢、自由基产生、铁硫簇组装及铁代谢水平的改变.顺乌头酸酶活性的传统检测方法通常是测定细胞中总的顺乌头酸酶活性,该方法难以准确区分出c-Aco和m-Aco各自的活性变化.因此我们建立一种胶内酶活性分析法检测顺乌头酸酶活性.该方法利用非变性电泳技术将c-Aco和m-Aco浓缩分离,通过泡染底物显色,条带颜色深浅反映了酶活性的强弱.同时,比较了胶内酶活性分析法和分光光度法检测细胞内c-Aco和m-Aco的活性,并对比检测了过氧化氢处理细胞前后Aco活性的变化.结果显示,这两种方法均可敏感地检测出Aco的活性改变,并有广泛的细胞系实用性,但胶内酶活性分析法可区别测定c-Aco和m-Aco活性,不需繁琐的细胞质和线粒体分离,简便易行.文中介绍的线粒体分离纯化技术也为线粒体功能深入研究提供了一个快速、高效的分离纯化方法.

线粒体遗传性疾病的基因诊断

线粒体是真核细胞中一类重要的细胞器．是细胞氧化磷酸化产生ATP的主要场所。细胞内近90％的ATP由线粒体产生，而ATP对氨基酸、维生素辅因子、脂肪酸和铁硫簇生物合成等不同代谢途径都具有重要作用。因此。线粒体又被称为细胞的“能量工厂”。当线粒体基因发生突变时。线粒体的能量代谢也会发生异常．呼吸链氧化磷酸化功能缺陷．ATP合成减少．氧自由基合成增加等引起线粒体功能障碍．从而引起耳聋、神经病变、肌病、糖尿病和高血压等多种疾病．统称为狭义的线粒体遗传性疾病。另外．与线粒体组装相关的核基因发生突变也可导致线粒体结构或功能异常．这些变异所引起的疾病亦可称为线粒体遗传性疾病。