激光扫描共聚焦显微镜技术在医学院校创新型实验教学中的应用

针对大型仪器技术支撑实验教学的要求,开展创新型实践教学,通过优化激光扫描共聚焦显微镜技术的实验教学内容和方法,改变实验教学模式,推动大型仪器设备的共享应用。此技术在医学院校人才培养方式中的应用提高了实验教学改革的整体水平,加强了学生的科技创新能力培养。

少精子症患者精子鱼精蛋白表达及染色质包装质量

目的:探讨鱼精蛋白(PRM1和PRM2)和精子染色质包装质量对少精子症的影响。方法:参照WHO标准收集了28例少精子症、16例畸形精子症和15例正常对照精液标本。通过提取标本总RNA,经反转录和荧光定量PCR反应分别检测PRM1、PRM2和TRF2mRNA的相对表达量;标本纯化后进行涂片、CMA3染色,通过计算CMA3阳性率检测精子染色质包装质量。结果:少精子症组PRM1和PRM2mRNA相对表达量分别为正常对照组的25%(P<0.05)和20%(P<0.05),畸形精子症组与正常对照组比较差异无统计学意义;TRF2mRNA表达水平3组间差异无统计学意义;少精子症组CMA3阳性率(20.47%±1.19%)是正常对照组(10.69%±1.45%)的191%(P<0.001),畸形精子症组为14.31%±2.01%,与正常对照组比差异无统计学意义。结论:鱼精蛋白(PRM1和PRM2)mRNA表达量减少可能影响精子染色质包装,使得精子形成过程异常,从而导致成熟精子数量减少。

miR-21靶向PTEN调节PI3K/AKT通路对狼疮性肾炎患者肾小球系膜细胞增殖及炎性因子分泌的影响

目的:探讨miR-21靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)调节磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)增殖及炎性因子分泌的影响。方法:选取在我院经肾穿刺活检诊断为LN的30例患者的肾组织标本,qRT-PCR和western blot检测狼疮性肾炎肾组织中miR-21和PTEN的表达水平;HMCs随机分为5组:NC mimics组、miR-21 mimics组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-PTEN组和miR-21 mimics+pcDNA3.1-PTEN组;TargetScan预测miR-21与PTEN的结合位点;双荧光素酶报告基因验证miR-21与PTEN的靶向关系;细胞克隆形成实验检测miR-21靶向PTEN对HMCs增殖能力的影响;细胞流式术检测miR-21靶向PTEN对HMCs凋亡率的影响;ELISA检测miR-21靶向PTEN对HMCs炎性因子生成的影响;Western blot检测miR-21靶向PTEN调节PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果:miR-21在狼疮性肾炎肾组织中高表达(P=0.043),PTEN在狼疮性肾炎肾组织中低表达(P=0.037);miR-21与PTEN存在靶向关系,且miR-21靶向下调PTEN的表达(P=0.003);与NC mimics组比较,miR-21 mimics组细胞集落数目增加(P=0.003),凋亡率下降(P=0.003),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量增加(均P=0.000),PTEN蛋白表达水平下调(P=0.003)、PI3K和AKT蛋白表达水平上调(P=0.025,P=0.004);与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-PTEN组细胞集落数目减少(P=0.032),凋亡率上升(P=0.035),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量减少(P=0.003,P=0.037,P=0.029),PTEN蛋白表达水平上调(P=0.002)、PI3K和AKT蛋白表达水平明显下调(均P=0.003);与miR-21 mimics组比较,miR-21 mimics+pcDNA3.1-PTEN组细胞集落数目减少(P=0.003),凋亡率上升(P=0.000),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量减少(P=0.003,P=0.004,P=0.004),PTEN蛋白表达水平上调(P=0.003)、PI3K和AKT蛋白表达水平下调(P=0.031,P=0.039);与pcDNA3.1-PTEN组比较,miR-21 mimics+pcDNA3.1-PTEN组细胞集落数目增加(P=0.029),凋亡率下降(P=0.031),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量增加(P=0.000,P=0.003,P=0.003),PTEN蛋白表达水平下调(P=0.003),PI3K和AKT蛋白表达水平上调(P=0.002,P=0.003)。结论:miR-21靶向PTEN对人肾小球系膜细胞的增殖、凋亡及炎性因子的分泌有一定影响,可能与PI3K/AKT通路有关。

弓形虫致密颗粒蛋白的生物学功能研究进展

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种重要的人兽共患寄生原虫,具有中间宿主广泛、生活史复杂、传播方式多样、呈全球性分布等特点,可感染几乎所有的恒温动物,导致人兽共患的弓形虫病。弓形虫慢性感染约1/3的世界人口,对免疫缺陷患者、孕妇、孕畜的健康更是造成严重威胁。致密颗粒蛋白是由致密颗粒(弓形虫的一种亚细胞分泌器官)分泌的蛋白质,它们可通过操控宿主(细胞)基因表达、信号通路进而调控宿主细胞的免疫反应和细胞周期,并在蛋白质的转运和定位、营养物质的摄取、纳米管网络(IVN)的形成与稳定性的维持、逸出、慢性感染等生理过程中发挥重要作用。本文综述弓形虫致密颗粒蛋白基本生物学功能的最新研究进展,旨在为深入研究弓形虫的致病机制、鉴定新的抗弓形虫潜在药物靶点和疫苗候选分子提供借鉴。

一种检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株的构建

目的:构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株。方法:首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子“外排泵”基因copA的启动子融合构建响应铜离子的CopAp::gfpmut2-pET28a感应元件。然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌(E.coli)MC4100体内负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建。最后优化出最佳检测条件,并将其初步应用于检测水环境中铜离子。结果:相对野生型菌株,E.coliΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突变菌对铜离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05~2.5μmol/L(0.0032~0.16 mg/L)Cu2+;与原子吸收光谱法相比,其对生活饮用水中0.05 mg/L和1 mg/L铜离子的回收率分别为87.90%和104.37%。结论:本研究构建报告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定了技术基础。

US31介导人巨细胞病毒调控系统性红斑狼疮发生的机制研究

目的:研究人巨细胞病毒(HCMV)基因US31调控系统性红斑狼疮(SLE)发生发展的机制。方法:征集临床60例SLE患者和111例健康志愿者,检测SLE患者与健康志愿者血清中抗HCMV-IgG及IgM抗体滴度,检测外周血白细胞中HCMV UL55基因表达,聚类分析SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)中HCMV病毒基因表达谱,鉴定在SLE患者中相对特异性高表达的病毒基因。另外,构建过表达US31基因的重组腺病毒(AdUS31),感染THP1单核细胞和THP1源性的巨噬细胞,分析US31基因对单核-巨噬细胞功能的影响。其次,筛选与US31相互作用的蛋白,细胞水平检测NF-κB相关通路蛋白变化,炎症相关基因TNF-α、IL-8、CCL2、ICAM1变化。分离细胞核和细胞质中的蛋白质,检测US31蛋白细胞定位,细胞水平感染过表达US31蛋白的重组腺病毒后抑制MG132蛋白酶表达,检测NF-κB相关通路蛋白变化。结果:SLE患者的抗HCMV-IgG及IgM抗体滴度均明显高于对照组(P<0.05),SLE患者外周血白细胞HCMV检测阳性率明显高于健康志愿者(P<0.001),全转录组测序和mRNA测序显示US31是SLE患者相对特异高表达的病毒基因,进一步研究显示,SLE患者PBMC中US31表达水平明显高于健康对照人群(P<0.001)。炎症相关基因TNF-α、IL-8、CCL2、ICAM1表达量升高(P<0.001)。NF-κB非经典途径的NF-κB2及前体p100可与US31直接相互作用,US31表达可明显促激活状态的NF-κB2(p52)表达。结论:HCMV诱导US31的表达通过与NF-κB通路相互联系直接改变炎症相关基因的表达,进而调控SLE发生。

真核细胞顺乌头酸酶活性检测新技术——胶内酶活性分析法

顺乌头酸酶(aconitase,Aco)是细胞内重要的铁硫蛋白酶,它催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸.真核细胞中顺乌头酸酶有两种,分别定位在细胞质的顺乌头酸酶1(cAco)和定位在线粒体的顺乌头酸酶2(m-Aco).检测它们活性的变化能敏感地反映出细胞中能量代谢、自由基产生、铁硫簇组装及铁代谢水平的改变.顺乌头酸酶活性的传统检测方法通常是测定细胞中总的顺乌头酸酶活性,该方法难以准确区分出c-Aco和m-Aco各自的活性变化.因此我们建立一种胶内酶活性分析法检测顺乌头酸酶活性.该方法利用非变性电泳技术将c-Aco和m-Aco浓缩分离,通过泡染底物显色,条带颜色深浅反映了酶活性的强弱.同时,比较了胶内酶活性分析法和分光光度法检测细胞内c-Aco和m-Aco的活性,并对比检测了过氧化氢处理细胞前后Aco活性的变化.结果显示,这两种方法均可敏感地检测出Aco的活性改变,并有广泛的细胞系实用性,但胶内酶活性分析法可区别测定c-Aco和m-Aco活性,不需繁琐的细胞质和线粒体分离,简便易行.文中介绍的线粒体分离纯化技术也为线粒体功能深入研究提供了一个快速、高效的分离纯化方法.

高谷氨酸环境下肌肽对星形胶质细胞谷氨酸转运体-1表达及活性的正调节作用

目的探讨肌肽在高浓度谷氨酸作用下对星形胶质细胞谷氨酸转运体一1（GLT一1）和谷氨酸一天冬氨酸转运体（GLAST）的表达及活性的影响。方法胶质原纤维酸性蛋白免疫染色法鉴定培养的星形胶质细胞纯度。谷氨酸10mm01．L。作用星形胶质细胞24，48和72h，MTT法和细胞核荧光双染法检测细胞存活率及细胞死亡模式。肌肽5mmol·L^-1预处理30min后，加入谷氨酸10mmol·L^-1作用24h，采用免疫组织化学法和实时荧光定量PCR分别检测GLT-1和GLAST蛋白及mRNA表达。采用实时荧光定量PCR检测肌肽5mmol·L^-1单独作用1—5d后，GLT-1mRNA和GLASTmRNA表达。肌肽5mmol·L^-1预处理30min再加谷氨酸10mmol·L^-1作用30min后，用高效液相色谱法检测胞外上清液谷氨酸含量。结果培养的星形胶质细胞纯度在95％以上。谷氨酸10mmol·L^-1攻击48h内不影响星形胶质细胞存活，而攻击72h星形胶质细胞存活率下降至82．0％，细胞凋亡率增加至24．7％。肌肽5mmol·L^-1预处理30min，则能显著上调高谷氨酸环境下星形胶质细胞GLT-1mRNA及蛋白的表达（P〈0．05），但不影响GLAST的表达。肌肽单独处理1—5d不影响GLT-1和GLASTmRNA的表达。肌肽预处理能显著提高星形胶质细胞对胞外谷氨酸的摄取能力。结论在高浓度谷氨酸条件下，肌肽能促进星形胶质细胞对胞外谷氨酸的快速摄取，同时上调GLT-1的表达，但不影响GLAST的表达。

氧化还原对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的调控

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(E.coli TopA)属于I型拓扑异构酶,在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程中发挥关键作用。E.coli TopA不仅能结合锌,还可以结合铁。细胞内过量铁可与锌竞争,通过与锌指结构域结合减弱其DNA结合能力和改变蛋白质空间构象,从而抑制TopA拓扑异构酶活性。然而,铁结合形式TopA的氧化还原特性以及氧化还原条件对其活性的影响仍不清楚。本研究通过紫外分光光谱和体外DNA拓扑异构酶活性分析,发现体外纯化得到的铁结合形式的TopA呈氧化状态,能够被二硫苏糖醇和连二亚硫酸钠还原,原本氧化状态下无活性的TopA在还原条件下,可恢复其拓扑异构酶活性。当还原剂被去除后,铁结合的TopA在空气中能够重新被氧化,且其活性重新受到抑制。这说明,氧化还原条件对铁结合的TopA功能具有可逆调节作用。通过金属-蛋白体外结合实验进一步发现,无金属结合的TopA蛋白(apo-TopA)在无氧条件下,与Fe^(2+)和Fe^(3+)均能结合,但与Fe^(2+)结合能力较弱,并且TopA结合的Fe^(3+)被还原成Fe^(2+)后,结合力显著下降,能够被铁螯合指示剂菲咯嗪快速捕获。此外,蛋白质内源性荧光光谱分析实验表明,铁结合的TopA在氧化还原的不同状态时,其在330 nm左右的荧光值有显著差异。这提示,氧化还原条件可能通过影响铁离子与TopA的结合状态,引起蛋白质空间构象改变,从而对TopA的拓扑异构酶活性进行调节。此研究表明,铁结合TopA的拓扑异构酶活性会受到细胞内氧化还原信号的可逆调控,也提示I型拓扑异构酶可能是细胞铁超载通过氧化损伤引起细胞功能障碍(或铁死亡)的靶点之一。

大肠杆菌YacG锌指结构的金属结合及功能特性

Yac G蛋白是一种能够抑制大肠杆菌促旋酶(E.coli gyrase)活性的内源性小分子蛋白质,仅由65个氨基酸残基组成。核磁共振(NMR)研究发现,Yac G结构中含有1个Cys-X2-Cys-X15-CysX3-Cys序列的锌指结构域,然而其作用并不清楚。本研究发现,在添加外源锌或者铁的M9基础培养基中,表达并纯化得到分别含有锌和铁的Yac G蛋白,而在同时添加铁和L-半胱氨酸的M9基础培养基中可以纯化得到含有铁硫簇的蛋白质。这表明,Yac G不仅是一个锌指蛋白,也是铁结合或铁硫簇结合蛋白。定点突变实验发现,Yac G锌指结构中的4个半胱氨酸残基突变后,其结合的锌、铁、铁硫簇的含量都显著下降。这提示,锌结合、铁结合以及铁硫簇结合的位点均位于锌指结构域中的4个半胱氨酸残基。体内Yac G过表达实验显示,用IPTG在大肠杆菌体内诱导表达野生型Yac G蛋白会导致其生长明显受到抑制,而过表达突变体蛋白(Yac G-C12/28S)对其生长的抑制作用将会减弱。体外实验进一步发现,锌结合、铁结合以及铁硫簇结合形式的Yac G蛋白对E.coli gyrase促DNA螺旋活性的抑制作用没有明显差别,但是锌指结构突变体蛋白(Yac G-C12/28S)对gyrase活性的抑制作用显著减弱。这说明,完整的锌指结构对Yac G抑制gyrase活性的功能具有重要作用。此研究有可能为gyrase抑制剂类抗生素药物的研发提供有用的线索。

三七皂苷R1对胺碘酮诱导成纤维细胞氧化应激的干预作用

目的:探讨不同浓度的三七皂苷R1对胺碘酮诱导人胚肺成纤维细胞(HELFs)氧化应激损伤的影响。方法:将HELFs分为对照组、胺碘酮组、三七皂苷R1干预组和三七皂苷R1对照组,分别予单纯细胞培养、加入6 μg/mL胺碘酮、加入6 μg/mL胺碘酮+(25、50、100 μg/mL)三七皂苷R1、加100 μg/mL三七皂苷R1干预。用倒置光学显微镜观察细胞形态改变,CCK8法检测细胞增殖活性,荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞活性氧(ROS)水平,酶生物法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果:胺碘酮作用于HELFs后,细胞变细变长,呈扁平狭长的梭形,而三七皂苷R1干预组细胞未出现明显的形态学改变;与对照组相比,胺碘酮还可以造成细胞增殖活性升高,细胞内ROS活性升高、SOD活性降低和MDA含量升高(P<0.05)。与胺碘酮组相比,一定浓度的三七皂苷R1能抑制细胞增殖,显著降低ROS活性和MDA水平,明显升高SOD 活性(P<0.05)。结论:胺碘酮能诱发HELFs增殖和氧化应激,而三七皂苷R1对其具有一定的保护作用。

半胱氨酸脱硫酶突变体H104Q,E156Q,D180G,Q183E和K206A通过改变对磷酸吡哆醛的结合影响酶活性

大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase,Isc S)是一类依赖磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)的同质二聚体的酶.IscS能催化游离底物L-半胱氨酸脱硫,生成L-丙氨酸和单质硫.在此催化过程中,可形成与酶结合的半胱氨酸过硫化物中间物,并出现了7种具有不同特征性吸收峰的中间反应物.为了研究PLP的结合及中间反应物的形成及累积,对IscS中与PLP结合相关,及IscS半胱氨酸活性口袋中特定氨基酸残基位点(His104,Glu156,Asp180,Gln183和Lys206)进行定点突变,结果发现:1)IscS突变体H104Q、D180G、Q183E、K206A对PLP的结合能力具有不同程度的减弱,酶的活性明显降低甚至消失,PLP与蛋白结合的特异吸收峰消失,或发生明显偏移并出现新的吸收峰,且这些新出现的吸收峰又与蛋白形成的各种中间反应物的吸收峰一致;2)IscS突变体E156Q的活性增高,PLP与蛋白结合的吸收峰明显增加.这些结果都表明,IscS氨基酸残基可通过影响PLP的结合及质子转移引起催化过程中不同中间反应物的形成及累积,同时提高或降低蛋白的活性.

循环游离DNA检测及其临床应用进展

循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cf DNA)是指存在于人体血液循环中的、游离于细胞外的高度片段化DNA。在特定情况下(如肿瘤患者、孕妇、接受器官移植的患者等),一小部分来自"异源性"细胞的cf DNA(如肿瘤细胞、胎儿细胞、或供体细胞)可以作为基因检测的标志物。基于cf DNA检测的"液态活检"技术在产前诊断、肿瘤的筛查、早期诊断、治疗监测和预后评估等多个方面受到极大的关注。该文就cf DNA的产生与特征、检测方法、检测指标、临床应用等作一总结及论述。

聚异丁烯及其热塑性弹性体:怎样从工业走向医疗

背景:聚异丁烯嵌段共聚物及其交联产物是一类新型的热塑性弹性体,具有独特性质和优异的生物相容性,有望作为医用生物材料得到广泛应用。目的:综述聚异丁烯及其热塑性弹性体的研究进展及应用,讨论聚异丁烯类材料作为可植入医疗器材的应用前景。方法:应用计算机检索1958至2019年PubMed数据库、Web of science数据库、中国知网和万方平台收录的与聚异丁烯生物材料相关的文献。英文检索词为"polyisobutylene and block copolymer,polyisobutylene and thermoplastic elastomer,polyisobutylene and biomaterials,polyisobutylene and modification,polyisobutylene and medical application",中文检索词为"聚异丁烯,嵌段共聚物;聚异丁烯,热塑性弹性体;聚异丁烯,生物材料;聚异丁烯,修饰;聚异丁烯,医学应用",按纳入、排除标准最后共纳入文献65篇进行综述。结果与结论:聚异丁烯嵌段共聚物及其交联产物具有良好的生物相容性和稳定性。在充分利用聚异丁烯类材料自身优势的基础上,通过与不同材料的结合,利用新技术对其进行改性和修饰,未来在诸如眼科植入材料、软生物材料和药物控释载体等医用植入材料方面将展现出更强的竞争力。

规范病原学诊断路径促进感染性眼病精准医疗

感染性眼病是临床常见的眼部疾病,尤其是在发展中国家,其发病率较高。在我国,由角膜感染引起的角膜盲发病率仅次于白内障。因感染原因和部位的不同,其临床表现和预后也不一。轻微的眼部感染仅引起眼部不适症状,如眼红、眼痒和异物感等,而严重感染会引起角膜溃疡、化脓、穿孔以及眼内炎等,从而影响患者视力,严重者甚至有失明和眼球摘除的风险。因此,对眼部感染性疾病进行规范化诊治尤为重要。临床上需要临床医师和检验医师运用各种检查方法和检测技术对眼部感染性疾病进行快速的病原学诊断,同时结合特征性的临床体征,才能实现对疾病的精准治疗。然而,由于眼部组织结构的特殊性,综合医院检验科技术人员对眼部标本特点不熟悉,眼科医师缺少实验室基本技能的培训等原因,导致感染性眼病的病原学诊断成为难点,尤其是眼部样本的采集和预处理成为最大的困扰。随着各种眼部特殊检查设备以及实验室新技术的引入,加快了病原学诊断的发展步伐,从而更好地为感染性眼病的诊疗提供客观依据。

温州口岸截获蜱体内微生物群落结构、抗生素抗性基因及毒力因子的宏基因组分析

目的以宏基因组学为技术手段,了解温州口岸在进口南非盐湿牛皮上检疫发现的无色扇头蜱体内微生物群落结构特征,及抗生素抗性基因(ARGs)、毒力因子携带情况。方法将截获的蜱随机分成5份,经HiPure Bacterial DNA Kits提取DNA后,采用高通量测序的方法,分析其微生物群落结构、致病菌、抗生素抗性基因及毒力因子。结果5份样本微生物组成相似。在门水平上,均以厚壁菌门、变形菌门为主要菌门。其中厚壁菌门丰度最高,占全部门的66.00%以上。在属水平上,均以链球菌属(>55.30%)、芽孢杆菌属(>11.20%)为优势菌属。在全部蜱样本中均检测到变形链球菌、蜡样芽孢杆菌、肠沙门菌、肺炎链球菌等常见条件致病菌,占注释总水平的71.00%以上。抗性基因分析发现蜱样本含有Acr,bacA,mdtK,arnA,mdtH等16种抗性基因,其中Acr丰度最高(30.19%),其次是bacA(20.75%)。这些抗性基因分别介导对大环内酯类、氨基糖苷类、β-内酰胺酶、甘氨酰环素、吖啶黄素等多种抗菌药物的耐药。细菌毒力因子数据库(VFDB)注释分析发现蜱样本共有3923个毒力基因,主要与黏附(22.66%)、分泌系统(13.97%)、侵袭(13.56%)等毒力因子相关。结论无色扇头蜱体内病原体种类较多,检出肠沙门菌等危害较大的致病菌,同时携带大量抗生素抗性基因及毒力因子,因此相关部门及一线从业人员应注意防控跨境蜱传疾病传入,防止对我国公共卫生造成影响。

不同样本测序前处理方案对冠状病毒基因组高通量测序结果的影响

目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份,一份直接RNA测序(未扩增),另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大,但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性,而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。

铜对线粒体中铁硫蛋白功能的毒性机制研究

该文探讨了铜对线粒体内铁硫蛋白的毒性机理。通过包装慢病毒将Hep G2细胞中铜转运蛋白ATP7B(ATPase copper transporting beta)基因敲低,并用铜离子处理构建高铜细胞模型。通过免疫印迹、胶内酶活、紫外–可见光分光光度法检测细胞线粒体内铁硫蛋白、非铁硫蛋白及铁硫簇组装蛋白量和活性的改变;用电镜观察高铜模型中线粒体的形态改变;用海马能量代谢分析仪检测铜离子对细胞能量代谢的影响。结果发现,高铜细胞模型线粒体内铁硫簇组装蛋白ISCA2(ironsulfur cluster assembly 2)及ISCU(iron-sulfur cluster assembly enzyme)水平下降,抑制了铁硫簇的组装,并进一步影响了线粒体内[2Fe-2S]型及[4Fe-4S]型铁硫蛋白功能,但并不影响非铁硫蛋白。高铜状态也影响了呼吸链复合体活性及线粒体能量代谢,并导致线粒体形态发生改变。这些结果表明,异常累积的铜离子也会通过抑制线粒体中铁硫簇的组装,影响线粒体内铁硫蛋白的功能。

线粒体遗传性疾病的基因诊断

线粒体是真核细胞中一类重要的细胞器．是细胞氧化磷酸化产生ATP的主要场所。细胞内近90％的ATP由线粒体产生，而ATP对氨基酸、维生素辅因子、脂肪酸和铁硫簇生物合成等不同代谢途径都具有重要作用。因此。线粒体又被称为细胞的“能量工厂”。当线粒体基因发生突变时。线粒体的能量代谢也会发生异常．呼吸链氧化磷酸化功能缺陷．ATP合成减少．氧自由基合成增加等引起线粒体功能障碍．从而引起耳聋、神经病变、肌病、糖尿病和高血压等多种疾病．统称为狭义的线粒体遗传性疾病。另外．与线粒体组装相关的核基因发生突变也可导致线粒体结构或功能异常．这些变异所引起的疾病亦可称为线粒体遗传性疾病。

宏基因组分析城市休闲水域九山湖的微生物群落结构和抗性基因

【背景】城市水环境正面临着严峻的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)污染。然而关于城市休闲水域中ARGs的研究较少。【目的】对城市休闲水域夏冬季节的微生物群落和抗性基因组成进行研究分析,促进对休闲水域水生生态系统的认识。【方法】基于高通量测序技术,对休闲湖泊九山湖夏季和冬季的微生物及ARGs组成进行分析。【结果】在夏季和冬季样本中分别检测到148门和152门。变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)是两个季节样本的主要菌门。夏季优势属为聚球藻属(Synechococcus),冬季优势属为Liminohabitans。此外,共鉴定出449种抗性基因型(304种是两个季节所共有的抗性基因,66种是夏季特有的抗性基因,79种是冬季特有的抗性基因)。夏季样本中ARGs的相对丰度显著高于冬季。MCR-1.2和BcI分别是夏季和冬季水样的主要ARGs。九山湖样本检测到的抗性基因的耐药机制主要是抗生素外排、抗生素失活或抗生素靶位改变。冗余分析(redundancy analysis,RDA)和典型对应分析(canonical correspondence analysis,CCA)结果表明,环境因子与微生物群落和抗性基因的分布显著相关。【结论】九山湖冬季和夏季的微生物群落结构和抗性基因组成存在明显差异,为进一步认识和了解城市休闲水生生态系统的结构提供了有用的信息,并强调了水体的ARGs污染可能造成的健康危害。