Herpud1蛋白在同型半胱氨酸诱导的血管平滑肌细胞表型转化中的作用

目的探讨同型半胱氨酸诱导内质网应激诱导的泛素样结构域1蛋白(Herpud1)在同型半胱氨酸(Hcy)诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用.方法取雄性SpragueDawley大鼠胸主动脉,改良组织贴块法分离VSMC并进行培养,取第4~7代的VSMC用于实验.为明确Hcy能否诱导VSMC发生表型转化,将VSMC分为4组,即对照组以及Hcy100、500和1000μmol/L组.为明确内质网应激(ERS)是否参与VSMC表型转化,将VSMC分为3组,即对照组、Hcy500μmol/L组(Hcy组)和Hcy+4-苯基丁酸钠盐(4-PBA)2mg/ml组(Hcy+4-PBA组).为进一步验证Herpud1在VSMC表型转化中的作用,将VSMC分为对照组、Hcy组、Hcy+siRNA阴性对照(scrambled)组和Hcy+Herpud1siRNA组.免疫荧光法观察VSMC形态学变化和Herpud1蛋白改变.Westernblot法检测VSMC表型转化相关标志蛋白骨桥蛋白、钙调节蛋白(Calponin)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC),ERS相关蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶/内切核糖核酸酶肌醇需要酶1(IRE-1)、葡萄糖调节蛋白质78(GRP78)以及Herpud1蛋白的表达水平.实时荧光定量PCR法检测VSMCHerpud1mRNA的表达水平.结果(1)不同浓度Hcy对VSMC表型转化的影响:免疫荧光结果示,对照组VSMC成长梭形,肌丝明显,成束状分布,极性明显;干预24h后,Hcy100μmol/L组可见VSMC不同程度地变成椭圆形,肌丝分布紊乱,但仍具有一定极性;干预24h后,Hcy500μmol/L组VSMC肌丝不明显、极性缺失,而Hcy1000μmol/L组VSMC改变则与Hcy100μmol/L组类似.Westernblot结果显示,Hcy100μmol/L组VSMC骨桥蛋白表达水平高于对照组,SM-MHC表达水平则低于对照组(P均<0.05);Hcy500μmol/L组VSMC骨桥蛋白表达水平高于Hcy100μmol/L组,Calponin和SM-MHC表达水平则低于Hcy100μmol/L组(P均<0.05),而Hcy1000μmol/L组以上改变趋势不如500μmol/L明显.(2)ERS在VSMC表型转化中的作用:干预24h后,Hcy100、500和1000μmol/L组VSMCCHOP、IRE-1和GRP78蛋白表达水平均高于对照组(P均<0.05).Hcy+4-PBA组VSMCCHOP、IRE-1和GRP78蛋白表达水平低于Hcy组(P均<0.05).而且,Hcy+4-PBA组VSMC骨桥蛋白表达水平亦低于Hcy组(P<0.05),Calponin和SM-MHC蛋白的表达水平则高于Hcy组(P均<0.05).(3)Herpud1在Hcy诱导的VSMC表型转化中的表达:干预24h后,Hcy100、500和1000μmol/L组VSMCHerpud1蛋白表达水平均高于对照组(P均<0.05),且具有浓度依赖性.干预12h后,Hcy(500μmol/L)组VSMCHerpud1升高最为明显,干预48h后开始下降.Hcy组VSMCHerpud1mRNA表达水平在0.5、1、2、6、12、24h均高于对照组(P均<0.05),且具有一定的时间依赖性,以12h最为明显;Hcy+4-PBA组VSMCHerpud1mRNA表达水平在上述各时点均低于Hcy组.免疫荧光染色显示,对照组、Hcy组和Hcy+4-PBA组Herpud1均主要分布在细胞浆中的内质网,细胞核也有少量分布.Hcy组VSMCHerpud1蛋白表达水平高于对照组(P<0.05),Hcy+4-PBA组则低于Hcy组(P<0.01).(4)抑制Herpud1对Hcy诱导的VSMC表型转化的影响:Hcy+Herpud1siRNA组VSMC骨桥蛋白表达水平低于Hcy+siRNA阴性对照组(P<0.05),Calponin和SM-MHC蛋白表达水平则均高于Hcy+siRNA阴性对照组(P均<0.05).结论Herpud1在Hcy诱导的VSMC表型转化具有重要作用.