烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列,设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR,扩增出了1条约1.4 kb的带,将该片段进行DNA序列测定,其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致,但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上,获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达,其中一重组子经144 h诱导,植酸酶表达量至少为1.25 mg/ml,比同类报道的表达量高出60％以上,以植酸钠为底物测得酶活为11.17U/ml。

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

构建了含菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因BADH基因的重组植物表达载体pLM46,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化。在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获基因转化烟草植株4株。经W estern blot等方法检测,证明BADH基因在烟草转化植株中得到了表达。

大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及其在烟草中的表达

利用PCR克隆了大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因(betB),构建了含betB基因的重组植物表达质粒载体pLM47,并用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草叶片进行遗传转化。结果表明,在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获得基因转化烟草植株3株;经报告基因GVS的组织化学检测和Western blot检测,证明betB基因在烟草转化植株中得到了表达。

甘露聚糖酶基因在烟草中的表达

构建了携带湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室克隆的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体pLM50,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),再用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化,在含卡那霉素的MS筛选分化培养基上筛选。结果获基因转化烟草植株4株;经PCR、Western blot等方法检测,证明man基因在烟草转化植株中得了表达。

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。

大豆叶绿体多顺反子单交换表达载体的构建

根据已知序列(GeneBankX076075),设计引物,用PCR方法获得了一段大豆叶绿体DNA片段,命名为soy。将来源于质粒pBluescriptSK( +)的含氨苄抗性基因Ampr和大肠杆菌质粒复制起始点ColE1ori的一段DNA片段克隆到这段大豆叶绿体DNA片段中,然后与由三个基因(壮观霉素抗性基因aadA、甘露聚糖酶基因man及绿色荧光蛋白基因gfp)串联的表达盒相连,以构建大豆叶绿体多顺反子表达载体pCS。并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹的方法对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定,结果表明同一多顺反子的三个基因均得到了表达。

番茄叶片再生系统建立的研究

比较了不同基本培养基、不同激素及其不同浓度组合对4个番茄栽培品种叶片诱导愈伤组织、不定芽分化及其生根的效果.结果表明:MS+6-BA 3.0mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30 mg/L(pH=5.8)对愈伤组织诱导及诱导愈伤组织分化不定芽的效果最佳;MS+IAA 0.1mg/L+蔗糖20mg/L培养基对生根最好。

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段(psbD/trnG),命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性,与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3′,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′t-rnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。

烟草质体多顺反子定点整合表达载体的构建和转化

构建了烟草质体多顺反子定点整合表达载体pLM4(-psaA-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3'-psbC-)。用基因枪将该载体轰击烟草叶片5次,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草6株。用PCR、激光扫描、Westernblot和RFLP等方法检测都证实多顺反子表达盒中的3个基因甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)、氨基糖苷3'-腺苷酰基转移酶基因(aadA)已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。

水稻质体多顺反子表达载体的构建及其对烟草质体的转化

目的尝试水稻质体多顺反子定点整合表达载体转化到烟草质体中表达。方法根据已发表的相关序列,分别设计引物,通过PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子定点整合表达载体所需的元件:质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子(Prrn)、质体psbA基因3′端终止子(psbA3′)、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因(aadA)、水稻质体基因组高频同源重组片段(psbC/trnG,大小3362bp),命名为crDNA、甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片5枪,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选。结果获得质体转基因烟草4株。用PCR、激光扫描和Westernblot等方法检测都证实man、gfp、aadA三个基因且均得到表达,用RFLP证实表达盒整合到烟草质体基因组中。结论水稻质体多顺反子定点整合表达载体已整合到烟草质体基因组中,并得到表达。

水稻多顺反子质体表达载体的构建

根据发表的水稻叶绿体基因组序列,对比烟草高频同源重组目标区(NCBI编号:X1 5 90 1 )设计引物,用PCR的方法克隆到一段3 . 939kb叶绿体DNA片段,命名为crDNA 以其作为外源基因定点整合的同源重组片段,以来自烟草叶绿体的强启动子Prrn、甘露聚糖酶man、绿荧光蛋白gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA和终止子psbA3’,构建水稻质体多顺反子表达载体pLM3(-psbC$CPrrn -SD -man -SD -gfp -SD -aadA -psbA3’-trnm - ) 并在大肠杆菌中通过平板定性对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定,结果表明:在大肠杆菌中,多顺反子盒式表达结构中的三个基因(man ,gfp ,aadA)

安全环保的烟草质体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据已发表的序列,通过PCR技术克隆了一系列构建烟草叶绿体多顺反子表达载体所需的元件:质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子(Prrn)、质体psbA基因3’端(psbA3’)、山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、烟草叶绿体高频同源重组片段(psaA/psbC,大小3463bp)、甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)。构建了烟草质体多顺反子定点整合表达载体pLM7(-psaA-Prrn-SD-man-SD-gfp-SD-BADH-psbA3’-psbC-)。并在大肠杆菌中通过平板定性分析等方法对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定。