湖北省部分肉鸡场致病性大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

对湖北省部分肉鸡场的大肠埃希菌病流行病学进行调查,从采集的50份发病及死亡鸡肝脏、心脏和气囊中共分离出21株大肠埃希菌,对其培养特性、形态特征、生化特性、致病性进行了研究,初步鉴定为大肠埃希菌。同时对分离的21株大肠埃希菌的O群抗原进行了血清型鉴定,其结果为10株O78、6株O18,2株O1,还有3株有待于进一步的血清型鉴定。动物试验表明,已鉴定出血清型的18株大肠埃希菌均有不同程度的致病性。选择临床上常用的15种药物进行药敏试验,结果显示鸡大肠埃希菌的耐药性已经到了非常严重的程度。

高致病性猪蓝耳病病毒湖北分离株细胞培养特性研究

高致病性猪蓝耳病是近年来严重危害我国养猪业的一种传染病.为了探明高致病性猪蓝耳病病毒在Marc145细胞上的增殖特性,本研究在分离获得高致病性猪蓝耳病病毒湖北株的基础上进行了细胞培养特性研究.结果表明:高致病性猪蓝耳病病毒湖北株在Marc145细胞上增殖所需的最佳条件分别为:营养液最佳血清含量为10%;最佳pH值为7.2～7.4;细胞最佳培养密度为105～ 2×105/mL;病毒增殖的最佳接毒量为8×103 TCID50/mL;病毒增殖的最佳吸附时间为37 ℃,60 min;最佳收毒时间为接毒后60～84 h;病毒最佳冻融次数为反复冻融3次.

TET蛋白在配子形成和早期胚胎中的作用研究进展

在哺乳动物配子形成和胚胎发育过程中,DNA甲基化水平一直处于动态变化,DNA甲基化水平的规律变化决定了配子的生成、分裂和成熟,尤其是在早期胚胎发育过程中DNA去甲基化与DNA甲基化共同决定了1枚胚胎能否发育为完整的个体。TET蛋白家族的各成员可以通过不同作用机制发挥去甲基化作用,并且不同种类TET蛋白的缺失会对胚胎发育产生不同程度的阻碍。大量研究表明TET蛋白在配子形成和早期胚胎发育不同阶段动态调控甲基化水平,目前关于TET蛋白生物功能还存在很大的研究空间。本文综述了TET蛋白家族成员的结构、作用机制以及在配子形成和胚胎发育过程中的生物功能,为深入研究TET蛋白功能提供参考。

多基因编辑技术的发展及其在畜牧种质创新中的应用

CRISPR基因编辑技术可以更精准、高效地更改基因组DNA序列,近年来在动植物育种中被广泛应用。实践中对农业生物多性状协同改良的需求越来越大,仅靠对单一基因或位点的改变不能满足上述需求,所以亟需建立一套多基因同步编辑体系,对多个基因进行协同修饰。多个sgRNA同时表达是多基因同步编辑的关键,常见表达策略包括建立多个单顺反子sgRNA并联表达和多顺反子sgRNA串联表达。常用串联表达工具有核酸酶Csy4、tRNA系统以及自裂核酶等。本文对以上多基因编辑技术的优劣进行了分析和总结,探讨了下一步的发展方向,并指出其重要意义和应用前景。

羊口疮病毒湖北株B2L基因的克隆与遗传进化分析

为了分析羊口疮病毒湖北株(ORFV-HB-YX株)B2L基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的ORFV-B2L基因序列设计特异性引物,对ORFV-HB株B2L基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示,B2L基因PCR扩增产物大小为1 137 bp,编码379个氨基酸,系统进化树显示HB-YX株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为97.0%~99.0%,与福建FJ-GS株同源性高达99%亲缘关系最近,属于同一分支。

靶向猪睾丸支持细胞PPP1CC基因siRNA的筛选与研究

本实验在验证PPP1CC基因在猪睾丸支持细胞ST内源性表达的基础上,针对PPP1CC mRNA靶序列设计并化学合成3段不同的siRNA序列,脂质体瞬时转染ST细胞,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测siRNA对ST细胞中PPP1CC的干扰效率。结果显示,转染24 h后,各实验组中PPP1CC mRNA表达量均显著低于阴性对照组,其中siRNA-1效果最佳。siRNA-1转染72 h后,PPP1CC蛋白表达量显著下降。本实验成功筛选出PPP1CC基因的有效干扰序列,为后续研究提供实验依据。

猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体的构建

本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞(ST)中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降(P<0.001),成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功构建重组质粒ACE-shSPAG6-pcDNA3.1,转染ST细胞48h后SPAG6蛋白表达量较阴性对照组显著下调(P<0.001)。本研究成功构建了猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体,并在ST细胞中验证了其具有较好的干扰效果。

山羊全混合日粮颗粒饲料适口性及贮存期研究

试验对山羊全混合日粮颗粒饲料适口性和贮存期进行了研究,结果表明:山羊全混合日粮颗粒饲料适口性良好,27头20 kg左右育肥波尔山羊自由采食,日喂2餐,平均日采食量为(0.854±0.031)kg/只;日喂3餐,平均日采食量为(0.978±0.031)kg/只;日喂4次,平均日采食量(0.976±0.029)kg/只;日喂料3次以上较2次喂料可提高山羊采食量14.3%。水或水蒸汽调质使羊全混合日粮颗粒料保质期大大缩短;不调质直接采用冷制粒加工,羊全混合日粮颗粒料的保存期可达到3个月以上,但制粒产量低。羊全混合日粮制粒加工宜采用冷制粒,直接压制成型,不宜使用水或蒸汽调质;山羊全混合日粮颗粒料具有良好的适口性,适宜的加工条件可使用其贮存期达到3个月以上。

非人灵长类动物基因编辑技术的应用及挑战

建立有效的动物模型是研究人类疾病演进、开发新型治疗手段的重要方法。非人灵长类动物在进化发育、生理生化及病理方面和人类最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。随着基因编辑技术的发展,研究者已经成功建立了多种模仿人类疾病的非人灵长类动物模型。但是CRISPR/Cas9的脱靶效应、嵌合突变以及基因敲入效率较低等突出问题也逐渐引起重视。本文综述了基因编辑技术在建立非人灵长类动物模型中的应用现状,提出了目前亟需解决的难点和应对策略,以期为高效、准确构建非人灵长类动物模型提供借鉴与参考。

基因组无痕修饰与动物转基因

动物转基因技术可以突破物种与年龄界限,有针对性地创造遗传变异.但是在转基因过程中,非目的序列的残留可能对后续研究造成障碍,甚至形成安全隐患.因此,对动物基因组进行无痕修饰的重要性日益凸显.基因组无痕修饰目前主要有两套策略.一是人工核酸酶的非整合导入,这主要是通过RNA或蛋白质的形式实现,可有效避免核酸酶质粒DNA的残留.二是转基因载体的优化及整合后删除,它是借助Piggybac系统,对末端重复单元之间的序列进行精确切离.本文总结了动物基因组无痕修饰的研究现状,并对其存在问题和应用前景做出评述,以期对我国的动物转基因研究和家畜转基因育种提供有益的参考和借鉴.

从随机整合到靶向修饰的转基因动物技术

转基因动物技术产生30年来取得了迅速发展,先后建立了多种转基因方法,尤其是从外源基因的随机整合发展到定位整合,成为定向进行动物遗传改造的强大工具。介绍各种转基因动物技术的建立及目前发展的概况,以及从随机整合到靶向修饰的发展过程。

热处理对改善皮蛋白碱伤效果研究

为了改善皮蛋腌制中的碱伤情况,提高皮蛋品质,本次研究对生产中出现轻度碱伤的皮蛋进行不同温度(40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃)和不同时长(2h、4h、6h、8h)的热处理,然后从产品感官品质、含水率和质构特性等方面进行分析。结果表明:热处理温度和时间控制在40～44℃、0～4h左右时,轻度碱伤的皮蛋基本恢复了原来形态,皮蛋白的光泽度、弹性、色泽等感官性状得以明显改善,皮蛋白的含水率也恢复到正常范围之内,其硬度、弹性、凝胶性等物理性质也较为理想。

波麻杂交羊毛色分化的初步研究

为了分析波尔山羊和麻城黑山羊杂交后代的毛色遗传分化,试验根据几种杂交模式对其毛色表现型进行观测。结果表明:波尔山羊对后代毛色的影响力很强,其棕头白身的毛色特征在69.75%的后代中得到不同程度体现,回交后的纯黑色和黑头白身个体比例有所提高,横交后代中黑头白身个体的比例高于其他组合。各毛色比例在公、母羊之间的差异均不显著,说明毛色遗传可能不受性别影响。窝内个体毛色对比发现,同窝个体并不一定具有相同毛色。研究提出波尔山羊和麻城黑山羊4个基因座的毛色遗传假说,包括基础色J(控制全身基础毛色)、头色T(头、颈部毛色)、斑块S(斑块色)和稀释因子X(影响毛色深浅)。

转绿色荧光蛋白标记基因猪整合检测的研究

[目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移植妊娠后生产仔猪,取耳或尾组织样提取基因组总DNA,用PCR法检测PM1在猪基因组中的整合情况。[结果]在所有生产的78头仔猪中,有6头猪用PCR检测为转PM1基因阳性猪,这6头猪在3次PCR扩增反应中都得到650 bp目的扩增片段。其他样品没有得到目的扩增片段的为阴性猪。[结论]载体PM1可以用于携带外源基因进行转基因猪生产。

“中苎1号”苎麻不同茬次的营养价值分析及在山羊中的饲喂效果研究

“中苎1号”是我国种植面积最大的苎麻品种之一,为促进其牧草化利用,通过化学检测方法对“中苎1号”连续7个茬次的营养成分进行系统分析,并研究“中苎1号”替代苜蓿对山羊生长性能和瘤胃发酵的影响。结果表明,各茬次苎麻的粗蛋白质含量呈现先升高后降低的趋势,且蛋白质品质良好;其微量元素含量丰富,而单宁的平均含量为0.58%,可能是主要的抗营养因子。与苜蓿型日粮相比,苎麻型日粮提高了山羊料重比(P<0.05),但不影响采食量和日增重(P>0.05),也不影响瘤胃氨态氮含量和短链脂肪酸组成(P>0.05)。“中苎1号”苎麻可以作为南方草食家畜的优质牧草,在养殖过程中可根据不同茬次的营养特点科学合理地定制饲料配方,以提高养殖效益。

用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系

肌肉生长抑制素(myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204bp的外显子3序列,LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。

猪肌内脂肪前体细胞分离培养和成脂诱导分化研究

为建立猪肌内脂肪前体细胞分离培养方法,为后续进行猪肌内脂肪沉积相关基因功能研究提供细胞模型,本研究采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法分离猪肌内脂肪前体细胞,通过诱导分化成功诱导出脂肪细胞,并进行油红O染色和甘油三酯含量检测。结果表明:采用胰酶消化结合细胞差速贴壁法能够成功分离出猪肌内脂肪前体细胞并稳定传代,获得的细胞纯度高,增殖和分化能力旺盛,具有典型特征的肌内脂肪前体细胞,冻存活率达90%以上;油红染色及甘油三酯含量检测结果显示,诱导分化第3天细胞内开始形成脂滴,第9天脂质沉积达高峰,继续培养至12 d甘油三酯含量增加不明显。综上,采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法能够获得稳定的猪肌内脂肪前体细胞,可为后续的基因功能分析提供实验素材。

缺失VIM基因大白猪肾成纤维细胞的构建及其NF-κB和MAPK信号通路的研究

波形蛋白(Vimentin,VIM)可介导多种病毒进入机体,为研究病毒的感染机理,本研究将合成的敲除VIM基因的双sgRNA克隆于pX459-puro载体中,构建pX459-puro-V-1和pX459-puro-V-2敲除载体,经电转至大白猪肾成纤维细胞中,经嘌呤霉素筛选出14株单克隆细胞株。将筛选的单克隆细胞株通过PCR鉴定、测序验证、western blot鉴定,结果显示得到1株缺失VIM基因的单克隆细胞。通过100 ng/mL的脂多糖(LPS)分别刺激该单克隆细胞株和可传代大白猪肾成纤维细胞,通过western blot检测NF-κB和MAPK信号通路中p65、p38、JNK、ERK及磷酸化蛋白p-p65、p-p38、p-JNK、p-ERK的表达水平,结果显示经LPS刺激后,缺失VIM基因的单克隆细胞和可传代大白猪肾成纤维细胞中p65、p38、JNK、ERK、p-ERK的表达水平均无明显变化;缺失VIM基因的单克隆细胞中p-p65、p-p38、p-JNK的表达水平明显低于可传代大白猪肾成纤维细胞(P<0.01)。本研究得到了1株缺失VIM基因的单克隆细胞,利用该细胞株首次研究发现VIM基因缺失能够影响宿主细胞中NF-κB和MAPK信号通路中p-p65、p-p38、p-JNK的表达,从而起到降低炎症反应的作用,该缺失VIM基因的单克隆细胞为病毒感染机理的研究提供了良好的实验素材,对相关疫病的防控有重要意义。

植物精油对产气荚膜梭菌感染肉仔鸡肠道损伤、肠道菌群CAZy谱和eggNOG通路的影响

本试验旨在研究日粮中添加植物精油对产气荚膜梭菌感染肉仔鸡肠道损伤、肠道菌群CAZy谱和eggNOG通路的影响。选取112只1日龄雄性爱拔益加(Arbor Acre)肉仔鸡,随机分为2组,每组7个重复,每个重复8只鸡。对照组(Ctrl)饲喂基础日粮,精油组(EO)在基础日粮中添加120 mg·kg^(-1)的植物精油(活性成分为香芹酚和百里香酚),所有肉仔鸡14~20 d连续每天灌服新鲜培养的产气荚膜梭菌菌液,试验第21天屠宰取样。观察肠道整体损伤程度进行肠道损伤评分,并采集回肠食糜进行宏基因组测序分析。结果显示:日粮中添加植物精油显著降低了肉仔鸡的肠道损伤评分(P<0.05);显著升高了回肠菌群碳水化合物活性酶数据库(carbohydrate-Active Enzymes,CAZy)第二层级以及EC层级大部分基因的丰度(q<0.05),其中糖基转移酶类的占比最高;改变了回肠微生物同源蛋白基因组的构成,普遍降低了直系同源蛋白分组比对数据库(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,eggNOG)第二层级以及直系同源群(Orthologous Group,OG)层级基因的丰度(q<0.05),且多数基因为细菌毒力相关基因,如Catalyzes_the synthesis of GMP from XMP、DsbA和dTDP-4-dehydrorhamnose 3,5-epimerase。上述结果表明,日粮中添加植物精油缓解了产气荚膜梭菌感染引起的肠道损伤,可能与调控肠道菌群碳水化合物酶和毒力相关基因的丰度有关。

J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达及间接ELISA方法建立

为建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)抗体间接ELISA方法,本实验根据已发表的ALV-J gp85基因序列设计一对特异性引物,以该病毒cDNA为模板进行PCR扩增,将目的基因克隆于pET-28a(+)载体中,原核表达的重组蛋白约为38 ku,经western blot分析表明,重组蛋白gp85具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法,该方法对其它相关的禽类病原无交叉反应,其组内和组间的变异系数均低于13%,具有良好的重复性。对458份临床血清样品进行检测,同时用IDEXX的同类ELISA抗体检测试剂盒进行对比,总符合率达到96.29%。本研究为ALV-J的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。