酿酒酵母F15和CC17共接种发酵对赤霞珠葡萄酒品质及感官特性的影响

为解决使用单一商业酵母菌株发酵引起的葡萄酒“同质化”问题,本研究以河北昌黎产赤霞珠葡萄为原料,以商业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)F15和本土优良酿酒酵母CC17为发酵剂进行单菌株和双菌株共接种(F15:CC17=1:1)发酵,同时监测酒精发酵过程中比重、温度、残糖、乙醇、总酸、pH、花青素、单宁、总酚、色度和色调的变化。发酵结束(192 h)后,分别对酒的香气成分和感官特性进行了测评。结果表明:与F15单菌株发酵相比,双菌株共接种发酵能够提高赤霞珠葡萄酒中花青素、单宁和总酚含量,增加酒的色度并使色调更趋向于红色;与CC17单发酵相比,共发酵组残糖、总酸含量较低;共发酵调谐主要香气成分,并增加饱和脂肪酸乙酯的含量。此外,感官评价结果表明共发酵葡萄酒色、香、味均优于F15单独发酵。因此,在酒精发酵过程中采用商业酵母与本土菌株共发酵是改善葡萄酒品质和感官特性有效方法。

毕赤酵母中外源表达脂肪酰-CoA还原酶生产脂肪醇

【目的】通过在毕赤酵母Komagataella pastoris GS115中外源表达来源于霍霍巴[Simmondsia chinensis(Jojoba)]的脂肪酰-Co A还原酶Jojoba FAR,利用微生物发酵生产脂肪醇。【方法】以质粒p RL105为模板PCR扩增获得霍霍巴脂肪酰-Co A还原酶的编码基因,以p GAPZαA为载体构建重组表达质粒p GAP-far,并通过电转化法转入K.pastoris GS115,筛选转化子并发酵,气相色谱-质谱联用检测发酵产物。【结果】构建了毕赤酵母重组菌株p GAPZ-far-GS115,通过摇瓶发酵检测到脂肪醇的合成。随后在7 L规模的发酵罐上发酵验证,得到脂肪醇产量为134.74 mg/L,产率为1.22 mg/(L·h)。【结论】实现了脂肪醇在毕赤酵母中的生物合成,为工业上利用毕赤酵母生产脂肪醇奠定了一定基础。

基于结构B因子分析指导的头孢菌素C酰化酶动力学稳定性改造

【目的】筛选Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ定点饱和突变库,获得动力学稳定性提高的头孢菌素C(CPC)酰化酶突变体,并对突变酶进行初步的结构-功能关系分析。【方法】靶标酶Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ与Pseudomonas diminuta N176具有较高的同源性,通过分析N176的结构B因子,构建CPC酰化酶SE83定点饱和突变库;基于pH指示剂显色法,采用Biomek FX^P自动工作站建立CPC酰化酶高通量筛选方法,获得优良突变酶,对其活性、稳定性等酶学性质进行表征;利用SWISS-MODEL对突变体进行同源建模,探讨突变体结构与功能的关系。【结果】通过B因子分析和同源结构比对,共找出9个靶标位点;经过3轮筛选,发现R218及K226位点突变显著提高酶的热稳定性,其中最显著的R218Q和K226V在40°C的半衰期分别为野生型的3.77和2.77倍,催化效率k_(cat)/K_m分别为野生型的1.8和3.1倍。同源建模分析表明氢键作用和疏水相互作用的增加可能是突变体稳定性提高的原因。【结论】B因子指导的酶分子改造是一种高效可靠的动力学稳定性改造策略,突变体R218Q和K226V均可提高CPC酰化酶的稳定性和催化效率,对进一步的CPC酰化酶分子改造具有一定的参考价值和指导意义。

定量监控大肠杆菌主代谢目标蛋白质及中间代谢物

【目的】监控大肠杆菌(Escherichia coli)主代谢通路上蛋白表达状况及中间代谢物变化,为代谢工程改造提供基础性数据及检测方法。【方法】利用Skyline软件靶向设计主代谢(糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、混合酸发酵途径及脂肪酸合成途径)目标蛋白质label-free(MRM)方法对其相对定量监控;在相同质谱平台(Triple Quad 4500)上利用LC-MS/MS(MRM)方法对目标中间代谢物绝对定量监控。【结果】实验表明不同生长时期内(对数生长期、稳定期及衰亡期)大肠杆菌主代谢蛋白质表达表现出4种不同的变化现象,某一代谢通路上的单一蛋白不能反映该通路的表达状态;磷酸戊糖途径、混合酸发酵途径以及三羧酸循环途径中较多的蛋白质在衰亡期表达量最高,但几种目标中间代谢产物(ATP、ADP、AMP、NAD+、NADH、NADP+、NADPH、Co A、acetyl-Co A)的积累量与对数生长期相比,稳定期及衰亡期都相应减少(除了acetylCo A以外)。【结论】该文中使用的检测方法可以有效地反映大肠杆菌体内代谢的基本状况。