基于CRISPR/Cas9技术的SIRT3基因敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建与鉴定

【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设计sgRNA,连接pb-U6-puro-BFP质粒后转染3D4/21细胞,筛选单克隆细胞,结合Sanger测序、qPCR和Western blot技术对获得的单克隆细胞进行鉴定,进而获得SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21-SIRT3-KO),并以流感病毒A/WSN/33为研究对象,感染野生型和3D4/21-SIRT3-KO猪肺泡巨噬细胞,利用qPCR方法检测炎症相关因子IL-6、IL-8的表达水平,初步分析SIRT3基因在流感病毒感染诱导炎症反应的影响。【结果】Sanger测序结果显示,在挑选获得的敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞克隆中,SIRT3基因第2号外显子位点产生了碱基缺失,并导致移码突变;同时,利用qPCR和Western blot检测猪肺泡巨噬细胞中SIRT3 mRNA和蛋白水平的表达,结果显示与野生型细胞相比,3D4/21-SIRT3-KO细胞中SIRT3 mRNA和SIRT3蛋白均不表达;流感病毒感染SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞时发现,敲除SIRT3能显著加剧流感病毒感染诱导的炎症反应。【结论】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系,并初步分析了SIRT3在流感病毒感染中作用。

单细胞RNA测序在畜禽遗传育种中的研究进展

单细胞RNA测序(single cell RNA sequencing, scRNA-seq)是在单细胞水平上实现高通量测序的技术,可以用来研究特定细胞亚群基因表达的异质性,帮助我们识别未知或稀有的细胞类型,并为进一步的研究奠定基础。scRNA-seq技术的进步使其在肿瘤、临床医学和发育生物学等领域得到了广泛应用,但在畜禽育种中的研究还较少。本文介绍了scRNA-seq一般流程,着重阐述了其在畜禽的生殖分化、毛囊发育和肌肉生成等方面的研究现状以及前景,以期为scRNA-seq在畜禽遗传育种中的研究和应用提供理论依据。

猪重大育种价值基因及挖掘技术研究进展

随着分子生物学和动物遗传育种技术的快速发展,对于畜禽优良性状的研究已从对表型选育进入到对单个或多个重要性状关联基因的分子选育,如对猪肉质性状的相关研究,在影响猪背膘厚、肌内脂肪含量、火腿重量等方面筛选到许多关键基因。近年来,非洲猪瘟肆虐,对猪抗病的研究再次成为热点,也发现了众多关键基因,如CD163直接参与了猪呼吸与繁殖综合征病毒的侵入机制。除了疾病的影响外,繁殖性状对养猪业的发展也起着至关重要的作用。随着研究人员对各重要性状研究的不断深入,现已积累了大量重要育种价值基因的多维数据,且由此开发出了多种基因筛选技术,尤其是CRISPR-Cas9基因编辑技术的发现及其作为全基因组筛选工具的成功应用,以及在后基因组时代功能基因组筛选与多组学的联合应用等,进一步推动了遗传育种领域的发展。作者系统总结了猪肉质、抗病及繁殖性状相关的重要育种价值基因及其挖掘技术,以期为猪的遗传改良提供指导性建议和参考。

猪SCD5基因缺失对脂肪酸组成的影响研究

本实验旨在通过探究SCD5基因缺失后对脂肪酸种类与组成的影响,为猪肉品质的改良提供新靶标。利用CRISPR/Cas9技术对SCD5基因进行定点敲除,筛选获得纯合缺失单克隆细胞系,验证其敲除效率后,利用GC-FID对其脂肪酸含量进行检测分析。结果显示:SCD5基因缺失降低了其介导的限速反应产物C16:1和C18:1的相对含量;在几种重要的多不饱和脂肪酸中,SCD5缺失在降低二十碳五烯酸(EPA)含量的同时引起了二十二碳五烯酸(DPA)升高;细胞中的单不饱和脂肪酸(MUFAs)含量也随着SCD5的缺失而降低,但多不饱和脂肪酸(PUFAs)含量上调。同时,SCD5基因缺失下调了对线粒体脂肪酸β-氧化具有重要影响的芥酸含量。综上,SCD5对脂肪酸的种类与组成具有重要的调控作用,也提示了其在脂质合成及代谢、脂肪沉积方面的重要作用。

基于转录组测序探究地塞米松在前体脂肪细胞成脂分化过程中的作用机制

试验旨在研究地塞米松(DEX)在前体脂肪细胞成脂分化过程中的作用机制,为后续体外研究猪肌内脂肪(IMF)沉积的调控机制奠定前期基础。试验分别使用DEX及常用成脂诱导剂MDI(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L、地塞米松1μmol/L、胰岛素10μg/mL)处理3T3-L1细胞,利用GO Term和KEGG PATHWAY对差异基因进行功能及信号通路分析。结果发现:相比阴性对照组,MDI组和DEX组分别筛选到2280个、1188个差异表达基因,差异基因富集到血管相关平滑肌收缩、脂质生物合成、脂肪细胞分化等生物学过程;对2处理组间的差异基因集进行Venn分析,获得779个共有差异表达基因,其中上下调模式一致的差异表达基因751个,且显著富集到脂肪细胞分化、脂肪酸代谢过程和PPAR信号通路等。本研究鉴定出通过DEX诱导前体脂肪细胞成脂分化过程的关键基因Selenbp1、Arid5b、Rgs2、Metrnl、Acsl6、Hmgcs1等。

硒都黑猪AOPEP基因SNP筛选鉴定及其与肌内脂肪含量的关联分析

肌内脂肪(IMF)含量是影响猪肉风味的重要指标。本研究通过重测序方法筛选出影响猪IMF含量的SNP位点,并进一步利用SANGER测序法在硒都黑猪群体中筛选鉴定出猪AOPEP基因rs340610840、rs3470100435、rs34724762003个SNPs位点。通过关联分析发现这3个SNPs位点均与IMF含量显著相关,且3个SNPs位点紧密连锁,所构成的不同单倍型组合也与IMF含量显著相关。通过RNA稳定性分析发现,rs3470100435的C>A突变导致编码氨基酸由精氨酸变成甲硫氨酸,显著影响了AOPEP mRNA质心二级结构,且AOPEP蛋白与AGT、KRR1、LDLRAP1等10个蛋白存在相互作用。本研究发现了3个影响猪IMF含量的分子标记,且rs3470100435位点导致AOPEP mRNA二级结构发生变化,AOPEP可能与AGT和LDLRAP1蛋白互作,进而影响IMF性状。

PLINs基因对脂质的调控及其潜在的育种价值研究进展

周脂素蛋白家族(Perilipins,PLINs)有PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN4和PLIN55种蛋白,该蛋白家族定位于脂滴(Lipid Droplets,LDs)表面,与其他分子相互作用介导脂质的合成与分解。PLIN1可调控脂肪的蓄积,也是脂肪细胞分化的标志物之一。PLIN2是脂质蓄积最重要的调节因子之一,可促进脂质合成,抑制LDs中主要脂质甘油三酯(Triglycerides,TG)和胆固醇酯(Cholesterol Ester,CE)的分解。PLIN3是中性脂质形成的关键基因。PLIN4参与脂肪细胞分化,还可修补脂滴形态的缺陷。PLIN5在LD积累与缓解脂毒性中起关键作用。本文综述了近年关于PLINs家族调控脂质的研究现状及其在畜禽上的应用,旨在阐述其在畜禽生物育种中的潜在育种价值。

PLIN2调控宁乡猪原代肾成纤维细胞ω-3 PUFA组成的研究

为研究PLIN2基因对中国本土猪宁乡猪长链omega-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFA)的调控作用,利用CRISPR/Cas9技术敲除宁乡猪原代肾成纤维细胞PLIN2基因,获得PLIN2纯合敲除细胞系,检测其脂肪酸含量及组成变化。结果显示:与野生型细胞相比,PLIN2^(-/-)细胞的多不饱和脂肪酸总含量增加55.92%,ω-3 PUFA含量增加112.02%,多不饱和脂肪酸含量在总脂肪酸中的占比由27.78%增加至34.40%。因此,PLIN2基因对宁乡猪原代肾成纤维细胞多不饱和脂肪酸和ω-3PUFA的形成具有正向调控作用。本研究为揭示PLIN2调控脂肪酸的分子机理提供了重要参考,并为猪肉品质改良的生物育种提供了候选靶点。

副猪嗜血杆菌感染禁食初乳CD仔猪模型及感染相关表型组构建

研究旨在围绕副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,Gps)感染优化制备禁食初乳(Colostrum-Deprived Piglet,CD Piglet)仔猪,并构建Gps感染相关表型组。对同一家系的2头母猪经同一头公猪精液配种后,从2窝中选取体重相近的15头1日龄杜×长×大新生仔猪制备CD仔猪模型。攻毒前记录仔猪饲喂数据,并对Gps及其他易混合感染病原进行鉴定。30日龄实施攻毒,实验组(n=6)经气管接种2×10^(8)CFU细菌,对照组(n=3)注射等体积TSB培养基。攻毒前后,采集CD仔猪基础生长数据、血液参数及体温数据;攻毒后记录仔猪临床症状;剖检后对肺脏等关键组织进行Gps分菌鉴定和病理分析;qRT-PCR法检测肺脏等4个组织中细胞因子和肝脏、肺脏中急性期蛋白的表达情况。结果表明,攻毒前CD仔猪成活率达100%,各项基础指标正常;Gps感染后格拉瑟氏病症状明显。本研究建立了Gps感染的综合症状评分体系,并能够较好区分出轻重症感染猪。结合体温数据、血液参数、细胞因子和急性期蛋白检测,最终将综合症状评分、感染后体温上升至41℃以上、11项核心血液参数(MON%、MON#、WBC#、TP、ALB、ALT、CREA、GGT、GLU、LDL、LDH)、4种细胞因子(IL10、IL6、IL1B、IL8)和1种急性期蛋白(HP)初定为Gps感染的关键表型组。研究为利用实验性感染猪群开展针对Gps的抗病育种奠定了基础。

副猪嗜血杆菌感染猪脑组织中候选基因表达水平与DNA甲基化联合分析

为了揭示FRMD1、STXBP2和GBP13个候选基因在感染副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)仔猪脑部组织中的表达差异及启动子区DNA甲基化差异,试验将6头体重为8~10 kg的28日龄杜×长×大三元杂交断奶仔猪随机均分为对照组和GPS组,GPS组腹腔注射2×10^(9)cfu/mL的副猪嗜血杆菌SH0165菌株1 mL,对照组腹腔注射等量生理盐水,7 d后屠宰并取脑部组织,采用实时荧光定量PCR和重亚硫酸盐测序的方法检测候选基因的表达水平与启动子区DNA甲基化水平。结果表明:与对照组相比,感染副猪嗜血杆菌后仔猪脑组织中FRMD1基因的相对表达量极显著下调(P<0.01),STXBP2基因的相对表达量显著上调(P<0.05),GBP1基因相对表达量呈上调趋势(P>0.05)。感染副猪嗜血杆菌后仔猪脑组织中FRMD1基因启动子区甲基化频率由75.1%下降到65.5%(P<0.01),STXBP2基因启动子区甲基化频率由17.9%下降到8.9%(P<0.05),而GBP1基因启动子区甲基化频率由84.7%上升到97.3%(P<0.05)。说明感染副猪嗜血杆菌的仔猪脑组织中FRMD1和GBP1基因mRNA表达水平与启动子区DNA甲基化水平呈正相关关系,STXBP2基因mRNA表达水平与启动子区DNA甲基化水平呈负相关关系,启动子区DNA甲基化修饰可能对副猪嗜血杆菌感染过程中相关基因的表达存在不同调控方式。