利用基因芯片技术研究造血生长因子在脐静脉内皮细胞中的表达

为探讨利用基因芯片技术研究脐静脉内皮细胞中造血生长因子基因的表达情况 ,将体外培养的人脐静脉内皮细胞 (ECV30 4 )分为血管内皮生长因子 (VEGF)处理组 (添加 5 0ng ml的rhVEGF16 5 )和正常对照组 ;培养 2 4小时后收获细胞 ,提取总RNA ,制备Cy3 dUTP标记的对照组cDNA探针和Cy5 dUTP标记的VEGF组cDNA探针 ,并与表达谱芯片杂交。杂交信号经荧光共聚焦显微镜扫描后 ,计算机分析基因表达情况。结果显示 ,两组细胞均表达多种造血生长因子及受体如Epo R、GM CSF R、G CSF R、LIF、IL 3、TPO、Flt 3和SCF ;同时也表达多种生长因子 (VEGF、IGF2、PDGFA、PDGFB、TGFβ1)和生长因子受体 (神经纤维黏蛋白 1,神经纤维黏蛋白 2 ,TGFβ R1) ;此外 ,共有 2 4个基因存在差异表达。结论 :利用基因芯片技术能够在短时间内迅速而准确地分析脐静脉内皮细胞众多造血生长因子及其受体的表达情况 。

腺病毒介导的hVEGF_(165)基因治疗对骨髓移植后骨髓造血干细胞恢复的影响及其意义

目的 :探讨重组腺病毒Ad EGFP/hVEGF165介导的血管内皮细胞生长因子在骨髓移植后小鼠体内的表达效率及对骨髓造血干细胞恢复的影响。方法 :利用细菌内同源重组法快速构建复制缺陷型腺病毒Ad EGFP/hVEGF165,经尾静脉注射给同基因骨髓移植BALB/c小鼠 ;在移植后不同时间 ,通过荧光显微镜、RT PCR、免疫组化染色和ELISA方法检测外源基因在小鼠体内的表达 ;取移植后 30d小鼠骨髓单个核细胞并计数 ,随后进行脾集落形成单位试验 (CFU S)以评价VEGF基因转移组小鼠骨髓造血干细胞数量恢复情况。结果 :重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165介导的VEGF基因转移广泛分布在骨髓移植小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠和骨髓组织 ;小鼠血浆中VEGF浓度高峰出现在移植后 2d ;接受重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165基因干预治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数及其形成的脾集落数量明显高于其他对照组。结论 :腺病毒成功介导了hVEGF165基因在骨髓移植小鼠体内的稳定表达 ,明显促进骨髓移植小鼠骨髓造血干细胞数量的恢复 ,是骨髓单个核细胞数量增加的根本原因。

人生长激素慢病毒载体的构建及其在鼠骨骼肌成肌细胞中的表达

构建能表达人生长激素(hGH)的pLentivirus6/V5-hGH载体,并实现hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达。体外培养SD鼠骨骼肌成肌细胞,并通过免疫组织化学方法鉴定所得细胞、用台酚兰染色确定培养细胞的活性并绘制生长曲线。将目的基因hGH亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLentivirus6/V5-hGH。将pLenti6/V5-hGH及阳性对照质粒pLenti6/V5-EGFP分别用Lipofectamin2000介导转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。在激光共聚焦扫描显微镜下计数,确定阳性对照质粒的转染数,从而估计该基因的转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源生长激素(GH)的成肌细胞。收集转染及筛选后的细胞培养基,用放射免疫分析法(RIA)检测重组人生长激素(rhGH)的表达水平。聚合酶链式反应法(PCR)及DNA测序显示hGH基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;阳性对照质粒转染细胞24h后,在激光共聚焦显微镜下观察,其转染效率达40%以上。检测收集的上清,与对照组相比,有极显著差异(P<0.01),观察至第8周,rhGH仍持续稳定表达。通过检测培养的chang-liver肝细胞上清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的水平,验证了rhGH的生物学活性。实验通过培养高纯度的成肌细胞,构建了能在真核细胞内表达hGH的重组质粒pLenti6/V5-hGH,实现了hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达,并且获得的rhGH具有较强的促进肝细胞分泌IGF-1的能力。

慢病毒载体表达人B型利钠肽的方法学探索

目的探索构建能表达人B型利钠肽(hBNP)的pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP载体的方法,以实现人B型利钠肽基因在骨骼肌成肌细胞中长久、稳定的表达。方法将目的基因人B型利钠肽(hBNP)亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP。将pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP及阳性对照质粒pLenti6/V5-D-TOPO-GFP分别用lipo-fectamin2000介导转染293FF细胞,获得病毒颗粒;用病毒颗粒转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的瞬时转染数,从而估计该基因的瞬时转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源B型利钠肽(BNP)的成肌细胞。收集瞬时转染及筛选后的细胞培养基,用酶连结免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒检测人B型利钠肽(hBNP)的表达水平。结果聚合酶链式反应法及DNA测序显示人B型利钠肽基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;阳性对照质粒转染细胞12h后,在荧光显微镜下观察,其转染效率达60%以上。检测收集的上清,结果与阴性对照有显著差别(P<0.01),观察至第4周,人B型利钠肽(hBNP)仍持续稳定表达。结论本实验成功构建了能在真核细胞内表达人B型钠尿肽的重组质粒pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP,并且取得了较高的转染效率,因此慢病毒载体介导的基因治疗在心血管疾病中有乐观的应用前景。

血管内皮细胞生长因子基因治疗对骨髓微血管照射损伤的修复

目的 探讨内皮生长因子对骨髓移植小鼠骨髓微血管损伤修复的影响。方法 利用腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子1 6 5(hVEGF1 6 5)在骨髓移植小鼠体内表达 ,检测骨髓微血管系统和造血细胞容量变化。结果 +10d接受hVEGF1 6 5基因治疗的小鼠胫骨中央静脉肿胀程度明显轻于注射腺病毒AdEGFP组和常规移植组 (P <0 0 1) ;+2 0d时该组小鼠胫骨中央静脉直径、微血管灌注面积已恢复正常 (P >0 0 5 ) ,且骨髓细胞容量高于其他组 (P <0 0 5 )。结论 VEGF基因体内高效表达可以加快全身照射引起的骨髓移植小鼠骨髓微血管损伤的修复 ,重塑微血管结构 ,促进骨髓造血功能的重建。

重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165快速构建及在骨髓移植小鼠体内的分布和表达效率

目的 研究增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF16 5 )重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率。方法 利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad EGFP hVEGF16 5 ;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性 ;经尾静脉注射 3× 10 8PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB c小鼠 ,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠体内分布和hVEGF16 5的表达。结果 通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP hVEGF16 5 ;纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 10 1 0 ～ 10 1 1 PFU ml。Hela细胞感染病毒后经多次传代未见细胞病变。借助于荧光显微镜在不同时期观测到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠组织EGFP ;RT PCR分析和免疫组化染色显示脏器内有显著VEGF表达。各脏器未见明显毒性反应。ELISA法检测小鼠血浆中VEGF水平升高可达(86 6 6 7± 97 13)pg ml。结论 本研究结果证实细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,并成功介导了hVEGF16 5基因在骨髓移植小鼠体内的安全、稳定表达 ,为今后在骨髓移植过程中开展基因治疗奠定了基础。