GST-hDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定

目的 构建GST hDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GST hDaxx融合蛋白 ,并研究其与 p5 3的结合能力。方法 构建GST hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX 4T/hDaxx ,在大肠杆菌 (E .col i)中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后 ,Westernblot鉴定表达产物与纯化物。通过共免疫沉淀反应与Westernblot观察hDaxx与p5 3的结合反应。结果 在原核细胞中成功表达了GST hDaxx融合蛋白 ,hDaxx与 p5 3可发生共免疫沉淀反应。 结论 1.GST hDaxx融合蛋白成功表达 ;2 .hDaxx和 p5 3的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关。

hDaxx及其删除突变体在真核细胞中的表达与鉴定

目的 构建N端融合有Gal4DBD的hDaxx及 6种删除突变体 (△hDaxx)真核细胞表达质粒 ,并在HT1 0 80细胞中表达。方法 将hDaxx及△hDaxxcDNA酶切片段连接到载体pM1或pM2相应位点 ,构建真核细胞表达质粒pM hDaxx或pM △hDaxx。用SuperFectTM 脂转染试剂将质粒转染HT1 0 80细胞 ,细胞裂解液经SDS -PAGE及转硝酸纤维素膜后作Westernblot。结果 构建的pM hDaxx及 6种pM △hDaxx能在HT1 0 80细胞中高度表达hDaxx或△hDaxx。结论 N端融合有Gal4DBD的hDaxx及6种△hDaxx在真核细胞中成功表达。

GFP-hDaxx融合蛋白高表达抑制活化巨噬细胞分泌TNFα

目的 研究GFP -hDaxx融合蛋白 (GFP -hDaxx)即时高表达对激活巨噬细胞分泌TNFα的影响。方法 将GFP -hDaxx真核细胞表达载体pEGFP hDaxx转染巨噬细胞 ,用荧光显微镜观察GFP -hDaxx在巨噬细胞内的表达与定位。通过hDaxx在巨噬细胞内的即时高表达 ,测定LPS诱导激活巨噬细胞后 ,在 0 .5、4、1 2h时 ,活化巨噬细胞分泌细胞因子TNFα的含量。结果 GFP -hDaxx在巨噬细胞内即时高表达且定位于细胞核。GFP -hDaxx在巨噬细胞内的高表达 ,使LPS诱导活化的巨噬细胞分泌TNFα量明显降低 (在 4h及 1 2h时与对照组差异有显著性 ,P <0 .0 0 1 )。结论 hDaxx即时高表达降低活化的巨噬细胞分泌TNFα。

hDaxx融合蛋白在原核细胞中表达与纯化

目的：GST－hDaxx融合蛋白在原核细胞中表达并纯化，以便进一步在体外探讨hDaxx的生物学活性。方法：构建GST－hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX-4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后，Western blot鉴定表达产物及其纯化物。结果：pGEX-4T/hDaxx能用IPTG在E.coli中诱导表达GST－hDaxx融合蛋白。结论：原核细胞表达了GST－hDaxx融合蛋白。