化瘀解毒法对MCAO大鼠凝血酶及其受体、脑组织MCP-1、NF-κB的表达及中性粒细胞浸润的影响

目的:观察化瘀解毒法对MCAO大鼠凝血酶及其受体、大鼠脑组织中单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、核因子κB(NF-κB)的表达及中性粒细胞浸润的影响,探讨凝血酶与炎性因子之间的关联性及化瘀解毒法的干预作用。方法:MCAO大鼠分手术组、模型组、活血化瘀法组、清热解毒法组、化瘀解毒法组、阿加曲班组、PDTC组等7组,分组给药,检测各组大鼠给药后脑组织凝血酶及其受体、MCP-1和NF-κB的mRNA表达和蛋白表达水平,并观察缺血区脑组织中性粒细胞浸润情况。结果:模型组脑组织凝血酶及其受体、MCP-1、NF-κB的mRNA表达和蛋白表达均增强(P<0.05),各治疗组治疗后上述指标均下降(P<0.05),化瘀解毒法组较明显;各组大鼠脑组织内PAR-1、MCP-1、NF-κB的蛋白含量与凝血酶蛋白含量均呈正向直线相关(P<0.05);模型大鼠缺血脑组织中性粒细胞浸润明显,各治疗组均有明显改善。结论:凝血酶毒性和相关炎症反应之间存在关联性,化瘀解毒法可以抑制MCAO大鼠凝血酶毒性和炎症反应,活血化瘀法和清热解毒法之间存在协同作用。

急性脑梗死中医证型与血清ET-1、vWF、H-FABP、PAO的相关性研究

目的:探讨急性脑梗死中医证型与相关生物学指标的关系。方法:将90例急性脑梗死患者(AIC组)通过中医辨证分为风证、火热证、痰证、血瘀证、气虚证、阴虚阳亢证组各15例,ELISA法测定血清ET-1、vWF、H-FABP、PAO水平,并与15例正常健康者(对照组)进行比较。结果:急性脑梗死组血清ET-1、vWF、H-FABP、PAO含量较对照组明显升高,各中医证型之间差异有统计学意义。结论:血清ET-1、vWF、H-FABP、PAO水平有助于对急性脑梗死的病情程度和证型进行评估或判断,可初步作为急性脑梗死辨证分型的客观化指标。

急性脑梗死中医证候与血清vWF、PAO相关性的研究

目的:探讨急性脑梗死中医证候与相关生物学指标的关系,从微观辨证的角度阐明证候与疾病的关系。方法:用ELISA法测定90例急性脑梗死急性期患者和15例正常健康者血清vWF、PAO表达水平的变化。结果:病例组血清vWF、PAO含量较健康对照组均有不同程度升高。结论:vWF、PAO血清含量变化有助于对中风病病情程度和类别的评估或判断,可作为中风病辨证分型的客观化指标。

解毒化瘀方药物血清与药物血浆对模型PC12细胞蛋白酶活化受体-1、细胞外信号调节激酶1/2表达的影响

目的比较解毒化瘀方药物血清与药物血浆对凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤蛋白酶活化受体(PAR)-1、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2表达的差异。方法灌胃给药制备大鼠药物血清和药物血浆。采用三气培养箱和无糖DMEM培养液造成细胞缺氧模拟缺血,并同时加入150 U/m L凝血酶,建立体外缺氧合并凝血酶诱导的PC12细胞损伤模型。实验分为空白组、模型组、药物血清组及药物血浆组。实时荧光定量PCR检测细胞PAR-1、ERK1/2 m RNA表达,免疫荧光法检测细胞PAR-1、ERK1/2蛋白表达。结果与空白组比较,模型组PAR-1、ERK1/2 m RNA和蛋白表达增强(P<0.05);与模型组比较,药物血清组和药物血浆组PAR-1、ERK1/2 m RNA和蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01);药物血浆组PAR-1、ERK1/2表达较药物血清组下降(P<0.05)。结论解毒化瘀方药物血浆抗缺氧合并凝血酶诱导PC12细胞损伤作用优于其药物血清。

解毒化瘀方对凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤ERK1/2信号通路表达的影响

目的探讨急性缺血性中风(AIS)瘀毒病机的分子机制及解毒化瘀方对凝血酶合并缺氧损伤的保护作用。方法(1)用凝血酶合并缺氧损伤PC12细胞,模拟急性缺血性中风的体外细胞模型。(2)将细胞分为空白组,模型组,解毒化瘀方含药血浆组和PD98059组(MEK抑制剂组),应用荧光定量实时RT-PCR方法检测MEK1、PAR-1及ERK1/2的m RNA表达,应用免疫荧光法检测ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表达。结果 PCR结果提示:模型组MEK1、PAR-1及ERK1/2的m RNA表达与空白对照组相比显著升高(P<0.01),解毒化瘀方组和PD98059组MEK1、PAR-1及ERK1/2的m RNA表达较模型组显著降低(P<0.01),免疫荧光结果提示:解毒化瘀方组和PD98059组ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表达较模型组显著降低(P<0.01)。结论解毒化瘀方以凝血酶为作用的分子靶点,能够显著降低ERK1/2信号通路在缺血性中风体外细胞模型中的表达。

基于凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤的模型研究

目的探索凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳反应时间点,为进一步研究凝血酶在缺血性脑损伤中的意义提供实验方法。方法建立体外缺氧合并凝血酶诱导的PC12细胞损伤模型。按照常规细胞培养方法,采用三气培养箱(1%O2,5%CO2,94%N2)和无糖DMEM培养液造成细胞缺氧模拟缺血,并同时加入不同浓度的凝血酶(0、50、100、150和200U/mL),再将每组都作用于1、6、12、24h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)分析细胞的存活率、TUNEL法检测细胞的凋亡程度。结果随着缺氧时间的延长和凝血酶浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,TUNEL细胞阳性率和凋亡率逐渐升高。低浓度凝血酶(50U/mL)在缺氧1h后,与对照组(0U/mL)相比细胞存活率有所升高,提示低凝血酶可能有保护作用。尤以缺氧12h后开始细胞损伤更为明显,150U/mL凝血酶组作用12h后与对照组相比细胞存活率显著下降(P<0.01),凋亡率显著增加(P<0.05);且200U/mL凝血酶作用12h和150、200 U/mL凝血酶组作用24h后细胞存活率与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 150U/mL凝血酶在缺氧作用12h后为研究凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳模型条件。

MCAO大鼠不同时相血浆TAT、F1＋2、D-二聚体、vWF含量的变化

目的:通过观察大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠血浆TAT、F1+2、D-二聚体、v WF含量的动态变化,探讨MCAO大鼠缺血后血栓生物标记物的变化规律,为药物研究确定最佳观察时间点。方法:雄性SD大鼠56只,随机分为:假手术组,缺血后不同时相组(1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h),每组8只。线栓法制造大脑中动脉闭塞大鼠模型,用ELISA法检测大鼠血浆TAT、F1+2、D-二聚体、v WF的水平。结果:脑缺血后1h TAT的水平即上升且于24h达峰值;F1+2、D-二聚体的水平在缺血后1 h骤然升高并于6h达峰值;而v WF在缺血后1h即骤然升高达峰值,然后维持在稳定的较高水平。结论:MCAO大鼠在急性脑缺血后血浆TAT、D-二聚体、v WF、F1+2水平均升高,表现出不同的时程规律,它们的峰值均集中在缺血后6 h或24 h,提示脑缺血的早期即存在有凝血纤溶系统紊乱、血管内皮细胞损伤,缺血后24 h可作为药物研究的最佳观察时间点。

局灶性脑缺血大鼠凝血酶与炎症因子相关性研究

目的研究大鼠局灶性脑缺血后凝血酶(Thrombin)及其受体(PAR-1)和炎症因子单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、核转录因子κB(NF-κB)的时间变化规律过程及其相关性。方法线栓法建立左侧大脑中动脉闭塞大鼠模型(MCAO),分别在大鼠缺血后1h,6 h,24 h,48 h,72 h进行行为学评分,断头取脑,荧光定量实时PCR(Real-timePCR)方法检测脑组织内Thrombin、PAR-1及MCP-1、NF-κB的mRNA表达。结果大鼠缺血后,荧光定量实时PCR分析提示:Thrombin、PAR-1、NF-κB及MCP-1的mRNA在造模后开始明显升高,24 h达到高峰,后逐渐下降。结论脑缺血后,脑组织内炎症因子表达增多,其表达与凝血酶表达在时间上有相关性,凝血酶可能通过诱导脑组织表达和产生炎症因子,促发炎症反应,加重脑细胞的损害。

化痰通络汤对大鼠脑缺血再灌注后“肠-脑”轴损伤的保护作用

目的探讨化痰通络汤对大鼠脑缺血再灌注后“肠-脑”轴损伤的保护作用。方法60只雄性大鼠随机分为假手术组,模型组,化痰通络汤低、中、高剂量组(7.16、14.33、28.66 g/kg),阳性药物组(依达拉奉4 g/kg+丁酸梭菌5.0×108 cfu/mL),建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,采用神经功能评分和病理形态学检测评价脑组织损伤,ELISA法检测肠道及脑组织中MTL、SS、VIP、5-HT、NA、DA、TLR4、IL-1β、IL-6水平。结果与模型组比较,化痰通络汤中、高剂量组与阳性药物组大鼠神经功能缺损评分降低(P<0.01);化痰通络汤各剂量组、阳性药物组大鼠细胞损伤率降低(P<0.01),脑组织中TLR-4、IL-1β、IL-6、MTL、VIP、SS水平降低(P<0.05,P<0.01),5-HT、DA、NA水平升高(P<0.05,P<0.01),十二指肠中TLR-4、IL-1β、IL-6、VIP、SS、DA、NA水平降低(P<0.05,P<0.01),MTL、5-HT水平升高(P<0.01)。结论化痰通络汤能通过调节神经-内分泌-免疫系统,改善脑缺血再灌注后脑与肠的功能状态,实现对脑缺血再灌注损伤后的胃肠功能紊乱调节和脑保护作用。

黄芪甲苷配伍三七总皂苷对脑缺血大鼠BMSCs移植后血管新生的影响

目的:探讨黄芪甲苷(ASTⅣ)与三七总皂苷(NTS)配伍联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血大鼠神经修复和血管新生的影响。方法:大鼠随机分为假手术组,模型组,ASTⅣ配伍NTS低、高剂量组,骨髓间充质干细胞(BMSCs)输注组,BMSCs输注联合黄芪甲苷和三七总皂苷低(10,25 mg·kg^(-1)),高(20,50 mg·kg^(-1))剂量组。全骨髓贴壁法分离、纯化BMSCs,流式细胞术检测BMSCs表面标志物CD29,CD90,CD34,CD45阳性表达率。采用大脑中动脉阻塞建立局灶性脑缺血模型。BMSCs输注组尾静脉注射PKH26标记的BMSCs(1次/d);联用组尾静脉注射BMSCs(1次/d)并灌胃给药(2次/d);其他组灌胃给药,2次/d;假手术组、模型组灌胃等体积生理盐水。Longa法测定神经功能缺损症状,红四氮唑(TTC)染色测定脑梗死率、免疫荧光法观察BMSCs移植后的存活及向血管的分化[PKH26/血管内皮生长因子(VEGF)的双阳性表达],蛋白免疫印迹法(Western blot)检测血管生成素1(Ang1)和转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))蛋白的表达。结果:成功分离培养BMSCs,表面标志物CD29,CD90,CD34,CD45鉴定符合BMSCs特征。脑缺血后出现神经功能缺损症状,模型组神经功能缺损评分显著升高(P<0.01),脑梗死率显著增高(P<0.01),各药物及细胞移植均能不同程度减轻上述病理改变,其中效应最强为BMSCs输注联合高剂量ASTⅣ+NTS组(P<0.01),优于单用药物和单用BMSCs输注。脑缺血后脑血管损伤,输注BMSCs后,细胞可在缺血侧脑组织存活并促进血管新生,药物联合可增强其效应。脑缺血后,Ang1和TGF-β_(1)的表达增加,效应最强为BMSCs输注联合ASTⅣ+NTS组(P<0.01),优于单用药物和单用BMSCs输注。结论:ASTⅣ配伍NTS能促进骨髓间充质干细胞移植的存活,靶向修复脑缺血后受损血管促进血管新生,机制可能与改善脑缺血后脑内局部微环境,促进移植干细胞的存活和分化有关。

MCAO大鼠不同时相凝血酶mRNA、凝血酶蛋白的变化规律探讨

目的：通过观察大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型不同时相神经功能缺失评分以及脑组织凝血酶mRNA和蛋白的表达,探讨MCAO大鼠缺血后神经功能缺损症状及凝血酶的变化规律,为药物研究确定最佳观察时间点。方法：雄性SD大鼠35只,随机分为假手术组和缺血后不同时相（1、6、12、24、48、72h）组,每组5只。对缺血后不同时相组采用线栓法制造MCAO大鼠模型,各组在取材前均进行神经功能缺失评分,用荧光定量实时PCR法检测大鼠脑组织凝血酶mRNA的表达水平;Western blot法检测大鼠脑组织凝血酶蛋白表达水平。结果：假手术组大鼠无神经功能损伤的症状,缺血后1~72h组大鼠表现为对侧前爪内收、向对侧转圈行走、向对侧倾倒等,以缺血后24h最为显著;大鼠脑缺血后1h凝血酶基因表达即增强且于24h达峰值;凝血酶蛋白的表达在脑缺血后1h即增多,持续上升到24h,然后维持在较稳定的高水平。结论：MCAO大鼠在急性脑缺血后凝血酶mRNA、凝血酶蛋白表达均增强,其峰值均集中在缺血后24h,此时大鼠神经功能缺损症状也最为显著,提示凝血酶可能参与了急性脑缺血的病理损害,缺血后24h可作为药物研究的最佳观察时间点。

化痰通络汤对脑缺血/再灌注大鼠“肠-脑”轴的干预作用

目的:基于"肠-脑"轴探讨化痰通络汤(HTTLD)对大鼠脑缺血再灌注后脑组织和肠道形态和功能的影响。方法:将60只SPF级雄性大鼠随机分为假手术组,模型组,HTTLD高、中、低剂量组(28.66,14.33,7.16 g·kg^(-1)),依达拉奉(4 g·kg^(-1))+丁酸梭菌(5.0×10^(8)cfu·mL^(-1))组,采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,灌胃给药HTTLD,神经功能缺损评分和2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法测定脑组织损伤,小肠推进率观察脑缺血再灌注对肠道动力的影响,十二指肠黏膜的病理形态学检测评价肠黏膜细胞损伤,酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清D-乳酸(D-LAC),二胺氧化酶(DAO),细菌内毒素(LPS)含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测十二指肠的闭合蛋白(Occludin),紧密连接蛋白-5(Claudin-5),闭锁小带蛋白-1(ZO-1)蛋白的表达。结果:脑缺血再灌注后,大鼠出现神经功能缺损症状,与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,HTTLD中、高剂量组能显著减少神经功能缺损症状,降低神经功能缺损评分(P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠脑组织出现明显梗死灶,脑梗死率显著升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组脑梗死体积明显减少(P<0.01),以HTTLD高剂量组的效应最佳,且效应具有剂量依赖性。小肠推进率结果显示,与假手术组比较,模型组小肠推进率显著降低(P<0.01);与模型组比较,各给药组能显著升高小肠推进率(P<0.01),以HTTLD高剂量效应最佳,且效应具有剂量依赖性。十二指肠黏膜组织病理学检测显示,脑缺血再灌注后十二指肠黏膜可见明显损伤,各给药组黏膜损伤情况明显减轻。与假手术组比较,模型组ZO-1,Occludin,Claudin-5蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组比较,HTTLD低、中、高剂量组能不同程度上调ZO-1,Occludin,Claudin-5蛋白表达(P<0.05,P<0.01),以高剂量组的效应最为显著。与假手术组比较,模型组血清DLAC,DAO,LPS蛋白含量均显著升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组D-LAC,DAO含量均明显降低(P<0.05,P<0.01),HTTLD中、高剂量组明显降低LPS含量(P<0.05,P<0.01),且HTTLD高剂量组的作用最明显。结论:脑缺血再灌注后,大鼠脑组织受损、出现神经功能障碍,同时肠道黏膜损伤、肠道蠕动减弱和肠道黏膜屏障破坏。HTTLD能减少脑组织和胃肠道黏膜损伤,减轻神经功能缺损症状,提高胃肠道动力、改善肠道屏障功能、减少肠道细菌代谢产物和毒物的释放,从而发挥对脑缺血再灌注后"脑-肠"轴损伤的保护作用。