电针胃经(穴)大鼠胃黏膜修复相关蛋白磷酸化信号转导通路的多途径变化

背景:近年来研究认为,胃黏膜损伤修复过程有多条信号转导通路参与,并与蛋白质广泛的发生磷酸化与去磷酸化有关,多个实验均从单个通路的角度验证这些观点。目的:课题组设计了全面、动态、定量观察电针足阳明胃经(穴)大鼠胃黏膜修复过程中是否有多个通路的参与的方案,并应用蛋白芯片技术观察相关蛋白磷酸化信号转导通路的多途径变化情况。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-11/2008-01在湖南中医药大学实验动物室和国家中医药管理局三级实验室、经穴与脏腑相关重点研究室完成。材料:健康雄性SD大鼠20只,随机选15只用无水乙醇灌胃法制备胃黏膜损伤大鼠模型,剩余5只为空白对照。方法:①空白组与模型组每天只捆绑不针刺。②针刺治疗组针刺大鼠双侧足三里、梁门、四白穴,接上G6805治疗仪,疏密波,频率4/50Hz,输出电压2～4V,强度以肢体轻微颤抖为度,30min/次,1次/d,连续7d。③针刺对照组则在同一时间针刺双侧的足三里、梁门、四白穴内侧约0.3cm的非经非穴点,其余的处理均同治疗对照组。主要观察指标:参照GUTH法行胃黏膜损伤指数;各组间上下调(磷酸化水平变化≥1.5倍)蛋白的归属通路的比较。结果:①模型组胃黏膜损伤指数高于空白组(P<0.01);针刺治疗组胃黏膜损伤指数值显著低于模型组和针刺对照组(P<0.01),而与空白组比较差异无显著性意义。②蛋白芯片分析示:针刺治疗组与针刺对照组均可上调或下调模型组的蛋白磷酸化的水平(≥1.5倍)。针刺治疗组与针刺对照组差异通路比较,磷酸化水平上调1.5倍蛋白中,针刺治疗组激活了6条通路,而针刺对照组只激活了5条通路,其中针刺对照组MAPKS通路缺如,磷酸化水平下调1.5倍蛋白中,针刺治疗组激活了3条通路,而针刺对照组只激活了一条通路,且无同名通路。结论:电针足阳明胃经(穴)修复胃黏膜引起大鼠胃黏膜损伤后修复信号蛋白的多个信号通路的激活,提示电针促胃黏膜修复机制是一个多通路、多水平的调节过程,其修复过程也是多通路、多靶点、多途径共同作用的结果。

针刺内关穴对心肌缺血／再灌注损伤大鼠脊髓背角和背根神经节内5-羟色胺表达的影响

目的探讨针刺内关穴对缺血／再灌注（I／R）损伤大鼠心肌的保护作用及其与脊髓背角和背根神经节（DRG）内5-羟色胺（5-HT）的关系。方法将40只大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、针刺组4组，每组10只。结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌I／R损伤模型，假手术组只穿线不结扎；针刺组在针刺大鼠内关穴5d后再行I／R。采用分光光度计测定血清缺血修饰白蛋白（IMA）含量，用免疫组化法测定脊髓背角和DRG内5-HT阳性表达量。结果模型组大鼠心肌I／R损伤后心电图STⅡ电位值、血清IMA含量、脊髓背角和DRG内5-HT阳性表达量均显著高于正常对照组和假手术组，而针刺组上述指标则较模型组显著降低（P〈O．05或P〈0．01）。结论针刺内关穴能减少血清IMA含量，降低心电图STⅡ电位值，对缺血心肌具有保护作用，其机制可能与针刺通过干预脊髓背角和DRG内5-HT的表达，抑制缺血伤害性刺激的传导，减轻心肌应激性损伤有关。

艾灸对脾虚大鼠小肠上皮线粒体超微结构及呼吸链酶含量的影响

目的:观察艾灸足三里等穴对脾虚大鼠一般症状积分、空肠组织线粒体结构、琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)含量及其亚基蛋白COXⅠ表达的影响,探讨艾灸温补脾胃改善脾虚证的作用机制.方法:40只SD大鼠随机分为4组:A空白对照组,B脾虚模型组,C艾灸穴位组(脾虚+艾条温和灸组),D中药对照组(脾虚+四君子汤组),每组10只.200%大黄水浸剂灌胃造成脾虚大鼠模型,艾灸足三里、中脘、关元、脾俞、胃俞等穴,观察大鼠一般症状,透射电镜观察大鼠空肠组织线粒体结构,酶联免疫法(ELISA)测定空肠上皮SDH和CCO含量,免疫印记(Western blot)方法测定空肠上皮细胞内细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome oxidaseⅠ,COXⅠ)蛋白表达.结果:与A组比较,B组脾虚模型大鼠脾虚症状积分显著增加(P<0.01),空肠上皮细胞线粒体超微结构严重破坏,空肠上皮细胞SDH和CCO含量及COXⅠ表达较A组显著降低(P<0.05或0.01).经艾灸足三里等穴或四君子药液灌胃治疗的C、D组空肠上皮细胞线粒体超微结构轻微损伤,空肠上皮细胞SDH、CCO含量及COXⅠ表达量均显著高于B组(0.387±0.076,0.343±0.053vs0.277±0.037;0.246±0.058,0.231±0.038vs0.167±0.021;0.941±0.204,1.040±0.214vs0.481±0.131,P<0.05或0.01),C、D两组比较无显著性差异.结论:艾灸足三里等穴可温补脾胃,改善大鼠脾虚症状,其机制与促进脾虚大鼠小肠上皮细胞线粒体结构恢复,增加呼吸链酶含量及其亚基蛋白的表达有关,提示艾灸可通过促进线粒体结构和功能的恢复,改善能量代谢.

电针对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦Ghrelin和GHSR蛋白及基因表达的影响

目的:探讨电针改善糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠胃运动的机制。方法:将48只健康SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、DGP模型组、电针穴位组(模型+电针穴位)、胃复安对照组(模型+胃复安灌胃)4组各12只。采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)配合高糖高脂饮食建立大鼠DGP模型,电针足三里、三阴交及梁门穴以观察大鼠血糖、尿糖值和胃排空率,ELISA法检测血清胰岛素(INS)、胃窦组织促生长素(Ghrelin)含量,PCR法测定胃窦部生长素促分泌激素受体基因(GHSR mRNA)表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠血糖、尿糖值显著增高,胃排空率、血清INS水平、胃窦Ghrelin及GHSR mRNA表达降低;经电针穴位后,血糖、尿糖值降低,胃排空率、血清INS水平、胃窦Ghrelin及GHSR mRNA表达增高。结论:电针足三里等穴位可降低DGP大鼠血糖、尿糖值,促进胃排空,这可能与其调节血清INS含量、胃窦Ghrelin及GHSR mRNA表达有关。

毫针不同刺激强度对胃扩张疼痛大鼠脊髓背角NMDA受体和P物质的影响

目的:探讨毫针不同刺激强度针刺足三里穴后对胃扩张大鼠的拟痛行为学、脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体表达和P物质(SP)含量的影响.方法:50只大鼠按完全随机法分成5组,分别为空白组、假手术组、模型组、轻手法组和重手法组.采用胃内植入气囊并充气压40mmHg造成胃扩张疼痛模型,轻手法和重手法针刺足三里穴为施治因素,以拟痛行为学评分标准观察其拟痛行为学,用免疫组织化学法检测脊髓背角中NMDA受体表达和SP含量.结果:与假手术组比较,胃扩张造模后,大鼠拟痛行为学评分和脊髓背角内NMDA受体均明显增加(P<0.01);轻、重手法针刺均能明显降低胃扩张疼痛大鼠的疼痛反应,与针前比较有非常显著性意义(11.77±2.16分vs22.83±1.87分,14.73±2.19分vs21.73±2.30分,均P<0.01);并能降低NMDAR受体(140.60±21.30vs240.20±25.59,63.60±13.74vs108.67±11.37,均P<0.01)、SP阳性细胞数(63.60±13.74vs108.67±11.37,82.67±12.13vs108.67±11.37,均P<0.01),与模型组比较差异有非常显著性意义;且轻手法组优于重手法组(P<0.01).结论:不同刺激强度针刺足三里后,减轻了胃扩张疼痛大鼠的应激反应,其作用机制是抑制脊髓背角内疼痛相关信息物质NMDA受体激活和SP的释放.

艾灸对脾虚大鼠空肠组织ATP含量和ATP酶活性的影响

目的观察艾灸对脾虚大鼠血清D木糖含量、空肠组织ATP含量及ATP酶活性的影响,探讨艾灸对ATP生成与膜蛋白含量的影响,分析艾灸温补脾胃改善脾虚证的作用机理。方法 40只SD大鼠随机分为4组:A空白对照组,B脾虚模型组,C艾灸穴位组(脾虚+艾条温和灸组),D中药对照组(脾虚+四君子汤组),每组10只。200%大黄水浸剂灌胃造成脾虚大鼠模型,艾灸足三里、中脘、关元、脾俞、胃俞等穴,间苯三酚法测定血清D-木糖含量,比色法测定空肠组织三磷酸腺苷(ATP)含量及Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)和Ca2+-Mg2+-ATP酶(Ca2+-Mg2+-ATPase)活性。结果与A组比较,B组脾虚模型大鼠血清D-木糖含量、空肠组织ATP含量、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均显著降低(P<0.05或P<0.01);与B组比较,经艾灸足三里等穴或四君子药液灌胃治疗的C、D两组血清D-木糖含量、空肠组织ATP含量、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均显著增高(P<0.05或P<0.01)。D组略优于C组,两组比较差异无显著性。结论艾灸能显著增加脾虚大鼠血清D-木糖含量,增加脾虚大鼠小肠组织ATP含量、ATP酶活性,提示艾灸可促进脾虚模型大鼠小肠上皮细胞ATP的生成,增加细胞膜蛋白的含量,改善物质跨膜转运,从而改善小肠吸收功能,促进脾虚症状恢复。

艾灸对急性胃黏膜损伤大鼠HSP60、HSP70表达的影响

目的观察艾灸中脘、足三里穴对急性胃黏膜损伤模型大鼠胃黏膜上皮HSP60、HSP70表达的影响。方法 32只SD大鼠完全随机分为空白组、模型组、艾灸穴位组和艾灸非穴位组。艾灸预处理大鼠8 d无水乙醇灌胃,造急性胃黏膜损伤模型。采用免疫组织化学法检测HSP60、HSP70的表达。结果与空白组比较,模型组中胃黏膜损伤指数、HSP60表达明显升高(P<0.01)。与模型组和艾灸非穴位组相比,艾灸穴位组胃黏膜损伤指数明显降低(P<0.01),HSP60、HSP70过度高表达(P<0.01)。结论艾灸中脘、足三里穴预处理能够降低无水乙醇对胃黏膜的损伤指数,诱导HSP60、HSP70的过度表达,减少伤害性刺激,从而起到保护胃黏膜的作用。艾灸穴位要比非穴位的作用更加明显,说明艾灸对胃黏膜保护作用具有一定的穴位特异性。

艾灸血浆对乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞的影响

目的:探讨艾灸血浆对乙醇损伤的离体人胃黏膜上皮细胞(GES-1)的保护作用.方法:将离体胃黏膜上皮细胞(GES-1)分为4组,即空白组、乙醇损伤模型组、艾灸穴位血浆组和艾灸非穴位血浆组.艾灸人体足三里、中脘、关元穴及非穴对照点前后提取并制备艾灸前后的血浆.以含8%乙醇培养液作用于后3组胃黏膜上皮细胞,建立胃黏膜上皮细胞损伤模型.各组分别加入预先提取的灸前血浆、艾灸穴位血浆和艾灸非穴位血浆.采用MTT法检测细胞抑制率,比色法检测细胞培养上清液中液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的含量,流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡率.结果:模型组与空白组比较,细胞A490降低(P<0.01),抑制率明显上升;与模型组比较,艾灸穴位血浆组A490升高(P<0.01),细胞抑制率降低;艾灸非穴位血浆组A490低于艾灸穴位血浆组A490(P<0.01),而细胞抑制率高于艾灸穴位血浆组(26.52%vs22.06%).与空白组比较,模型组培养液中LDH、MDA、SOD含量均有所提高(P<0.01或0.05);艾灸穴位血浆组与模型组比较,SOD水平升高(P<0.01),LDH、MDA含量降低(均P<0.01);艾灸非穴位血浆组与艾灸穴位血浆组比较,SOD水平下降(34.11kU/L±4.14kU/Lvs38.73kU/L±4.34kU/L,P<0.05),LDH和MDA水平升高(9.26U/L±1.62U/Lvs7.38U/L±1.28U/L;3.91μmoL/L±0.11μmoL/Lvs3.75μmoL/L±0.11μmoL/L,均P<0.05).艾灸非穴血浆组与艾灸穴位血浆组比较,细胞周期中各期无明显差异(均P>0.05),凋亡率升高(1.56%±0.19%vs1.24%±0.08%,P<0.01).结论:艾灸足三里、中脘、关元穴后提取的人体血浆对受损人胃黏膜细胞具有一定的保护作用.

艾灸血浆对GES-1热休克蛋白70及细胞凋亡细胞周期的影响

目的:探讨艾灸血浆对乙醇损伤的人胃粘膜上皮细胞(GES-1)热休克蛋白70(HSP70)及细胞凋亡、细胞周期的影响。方法:24名健康人(男女各半)随机分为艾灸穴位组12名、艾灸非穴位组12名。两组分别于艾灸前和艾灸后采取静脉血提取灸前血浆和灸后血浆。将GES-1细胞分为A空白组、B模型组、C艾灸穴位血浆组、D艾灸非穴位血浆组,采用含8%乙醇的培养液造成GES-1细胞损伤模型,观察艾灸血浆对GES-1 HSP 70及细胞凋亡、细胞周期的影响。结果:与模型组和艾灸非穴位血浆组比较,艾灸穴位血浆组GES-1中HSP70含量明显上调(1.1084±0.0771 vs 0.6387±0.0322,0.7220±0.0708,P<0.01)、细胞凋亡率下降(1.238±0.084 vs7.418±0.156,1.565±0.186,P<0.01);细胞周期中G1期下降:49.18±1.72 vs 57.9±1.42,52.5±2.83,P<0.01);S期上升(25.93±1.18 vs 21.5±0.35,23.55±1.54,P<0.01);G2/M期升高(24.88±1.17 vs 20.53±1.24,23.95±1.58,P<0.01)。结论:艾灸血浆可诱导GES-1中HSP70含量升高,以达到对抗细胞凋亡,促进细胞增殖的作用。

艾灸对幽门螺杆菌胃炎大鼠血清免疫学作用研究

目的:探讨艾灸保护胃黏膜损伤的免疫学机制。方法:将40只健康SD大鼠随机分为4组,即空白组、模型组、艾灸穴位组(模型+艾灸穴位)、艾灸非穴组(模型+艾灸穴位对照点),每组10只。艾灸穴位组和艾灸非穴组于造模前8天即予艾灸干预,穴取"足三里""中脘""关元""脾俞""胃俞"穴或以上穴旁开对照点,模型组仅捆绑不治疗,均每日1次,连续16d。采用幽门螺杆菌(Hp)灌胃建立大鼠Hp胃炎模型,观察大鼠胃黏膜苏木精-伊红(HE)染色镜检炎性反应程度,酶联免疫法(Elisa)检测各组大鼠血清热休克蛋白72(HSP72)及胃组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)含量,实时定量聚合酶链式反应(PCR)法检测外周血单核细胞Toll样受体(TLR2mRNA、TLR4mRNA、CD14mRNA)、髓样分化因子88(MyD88mRNA)的表达,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测外周血单核细胞NFκB核因子κB、IκBα核因子κB的抑制蛋白的含量。结果:与空白组比较,模型组大鼠胃黏膜涂片革兰氏染色检测出Hp,胃黏膜组织HE染色镜检炎性反应程度评分积分值增高,血清HSP72含量及胃组织TNF-α、IL-1β含量明显升高,单核细胞TLR2mRNA、4mRNA、CD14mRNA、MyD88mRNA、NFκB表达增加(P<0.01),IκBα表达降低(P<0.05);经艾灸"足三里"等穴预处理者,艾灸穴位组大鼠胃黏膜组织HE染色镜检炎症程度积分值减低,血清HSP72含量升高,胃组织TNF-α、IL-1β含量及单核细胞TLR2、4mRNA、CD14mRNA、MyD88mRNA、NFκB表达降低(P<0.01),IκBα表达升高(P<0.05);艾灸非穴组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:艾灸穴位预处理可诱导血清HSP72的高表达,通过与TLR2、4受体结合启动受体后信号转导途径,调控下游信号物质的释放,从而调节机体相关免疫物质的释放,减轻Hp胃炎大鼠胃黏膜损伤。

艾灸对脾虚大鼠小肠运动吸收功能及ATP含量的影响

目的:探讨艾灸温补脾胃的作用机制。方法:40只SD大鼠随机分为4组:空白对照组(A组),脾虚模型组(B组),艾灸穴位组(C组),中药对照组(D组)。采用200%大黄水浸剂灌胃造成脾虚大鼠模型,C组艾灸"足三里""中脘""关元""脾俞""胃俞"等穴,D组用中药四君子汤灌胃治疗,A组与B组不予治疗干预。观察大鼠一般症状,记录小肠推进率,间苯三酚法测定血清D-木糖含量,比色法测定空肠组织三磷酸腺苷(ATP)水平。结果:与A组比较,B组大鼠脾虚一般症状积分增高(P<0.01),小肠推进率、血清D-木糖含量以及空肠组织ATP含量均降低(P<0.05,P<0.01);与B组比较,C组和D组大鼠脾虚一般症状积分降低(均P<0.01),小肠推进率、血清D-木糖含量以及空肠组织ATP含量均增高(P<0.05,P<0.01);C、D两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:艾灸"足三里"等穴位可改善大鼠脾虚症状,增进小肠运动吸收功能,改善小肠能量代谢,与中药四君子汤疗效相当。

不同电针频率刺激对胃扩张疼痛大鼠下丘脑内P物质、β-内啡肽表达的影响

目的:通过比较不同电针频率刺激"足三里"对胃扩张疼痛大鼠的拟痛行为学评分和下丘脑内疼痛信息物质P物质(SP)、β-内啡肽(β-EP)的影响,阐明电针防治胃扩张疼痛可能的物质基础,探讨不同电针频率的效应差异。方法:50只大鼠完全随机分成空白组、假手术组、模型组、低频电针组和高频电针组,除空白组外采用胃内植入气囊并充气40mmHg压力造成胃扩张疼痛模型,低频(2Hz)和高频(100Hz)电针刺激"足三里"为施治因素,观察大鼠拟痛行为学评分,用免疫组化法检测下丘脑组织中SP、β-EP的表达。结果:低、高频电针均能明显降低胃扩张疼痛大鼠的拟疼痛行为学评分,与针前比较差异有统计学意义(P<0.01);且高频电针组优于低频电针组(P<0.01)。与空白组和假手术组比较,模型组下丘脑组织中SP、β-EP阳性细胞数明显增加(P<0.01),低、高频电针可使下丘脑组织中SP、β-EP阳性细胞数继续增加(P<0.01),且低频电针组的SP、β-EP阳性细胞数增加更明显(P<0.01)。结论:不同电针频率刺激"足三里"均可减轻胃扩张疼痛大鼠的应激反应,这可能是通过促进了下丘脑内疼痛信息物质SP、β-EP的合成与释放,从而发挥镇痛作用,且高频电针的镇痛效应优于低频针。

艾灸血浆对离体人胃黏膜上皮细胞损伤的保护作用及其线粒体细胞凋亡通路机制

目的:探讨艾灸血浆对胃黏膜细胞凋亡的影响,揭示艾灸对胃黏膜细胞的保护作用及其信号转导机制。方法:24名健康人随机等分为艾灸穴位组和艾灸非穴位组,分别艾灸中脘、关元和足三里穴及非穴位对照点各10 d。将人体胃黏膜上皮(GES-1)细胞分为空白组、模型组、艾灸穴位血浆组、艾灸非穴位血浆组,采用含8%乙醇的培养液造成GES-1细胞损伤模型,分别加以预先提取的灸前人体血浆、艾灸穴位和非穴位血浆。流式细胞技术检测细胞凋亡率;Western-blot法检测细胞内热休克蛋白70(HSP70)、第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活物(Smac)、凋亡诱导因子(AIF)的表达;细胞免疫化学法检测半胱氨酸天冬酸蛋白酶-3、9(Caspase-3、9)的表达。结果:模型组与空白组比较,细胞凋亡率明显增加,HSP70、Smac、AIF、Caspase-3、Caspase-9表达均上调(均P<0.01);艾灸穴位血浆组与模型组比较,凋亡率明显下降(P<0.01),HSP70表达进一步提高(P<0.01),Smac、AIF、Caspase-3、Caspase-9表达下调(均P<0.01);艾灸非穴位血浆组与模型组比较,凋亡率、Smac表达下降,Caspase-3、Caspase-9表达也下调(均P<0.01),但高于艾灸穴位血浆组(P<0.05,P<0.01)。结论:艾灸中脘、关元和足三里穴位后提取的人体血浆能抑制GES-1细胞凋亡,其信号转导通路可能是:促进细胞内HSP70合成,通过线粒体凋亡通路,抑制Smac、AIF表达,同时阻断其与Caspase-9的结合,减少Caspase-3含量,抑制细胞凋亡。