猪圆环病毒2型感染性克隆的构建及拯救病毒的双抗体夹心ELISA鉴定

旨在构建猪圆环病毒2型(PCV2)感染性克隆,并利用双抗体夹心ELISA对拯救病毒进行鉴定。通过PCR从阳性病料中扩增出PCV2两种基因型2b与2d的全基因组DNA,并分别克隆入pMD-19T载体,获得2个重组质粒,命名为p19T-PCV2b与p19T-PCV2d。利用SacⅡ酶切获得l 767 bp的PCV2全基因组,并在体外分别用T4连接酶连接而环化,将环状基因组转染至PK-15细胞,传至P6代,利用间接免疫荧光试验(IFA)对拯救病毒进行鉴定,结果表明PCV2b与PCV2d感染性克隆可拯救出病毒。利用PCV2单克隆抗体(单抗)作为捕获抗体,用辣根过氧化酶(HRP)标记的PCV2多抗作为检测抗体,建立检测PCV2病毒粒子的双抗体夹心ELISA方法,用于PCV2拯救病毒的鉴定。将该检测方法与IFA和半数组织细胞感染量(TCID_(50))结果进行对比分析,结果显示,ELISA检测值与Image-J所计算的IFA荧光强度及TCID_(50)的相关系数分别达到0.7和0.8以上,说明该方法与IFA及TCID_(50)检测结果均具有较强的一致性,可以用于PCV2拯救病毒的快速鉴定。

猪瘟E^rns蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其抗体间接ELISA方法的建立

将人工合成的CSFV E^rns基因插入到pFastBac1获得重组转移载体pFastBac1-E^rns,在DH10Bac大肠杆菌中转座后提取杆粒并转染Sf9细胞,用获得的重组杆状病毒感染High Five细胞表达E^rns蛋白并通过亲和层析进行纯化。以纯化后E^rns蛋白作为诊断抗原,通过摸索抗原包被量和抗体血清稀释倍数等条件,建立检测CSFV E^rns抗体的间接ELISA方法(E^rns-iELISA)。结果显示,E^rns蛋白得到有效表达,相对分子质量约为35000;确定的ELISA抗原包被量为120ng/孔、血清稀释100倍,酶标二抗稀释6000倍,封闭条件为37℃30min,TMB底物作用15min,临界值为0.329。用E^rns-iELISA方法检测92份阴性血清,其特异性为88.04%,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应;对171份阳性血清的敏感性为92.98%;批内和批间重复的平均变异系数为7.4%和10.74%。结果表明,本试验所建立的E^rns-iELISA方法重复性好,具有较高的检测特异性,且对CSFV疫苗毒和国内流行毒株都具有较高的检测敏感性,具有潜在的开发和应用价值。