水稻DUF760基因家族的全基因组鉴定与表达谱分析

为了探索DUF760基因家族在水稻生长发育中的潜在功能,对水稻DUF760基因家族进行了全基因组鉴定、分类、启动子序列分析和表达谱分析。通过生物信息学技术在水稻和拟南芥中分别鉴定了6,8个DUF760家族成员。系统进化树分析将这些家族成员分成2个亚家族,二者在蛋白保守基序和基因结构上也存在一些特征差别。水稻DUF760家族基因启动子区域存在多个响应逆境胁迫和植物激素的顺式作用元件,ABRE(脱落酸响应)元件存在于家族所有成员的启动子序列中,OsDUF760-1启动子区域拥有9个脱落酸(ABA)相关的响应元件。在ABA处理水稻后,OsDUF760-1的转录表达水平显著下调,而OsDUF760-3显著上调,二者在干旱胁迫处理水稻后的表达变化模式与ABA处理水稻后的表达变化模式一致,说明这2个基因可能通过ABA信号途径参与水稻干旱胁迫响应,并且扮演不同的角色。除对ABA和干旱胁迫处理具有较强响应外,水稻DUF760家族成员还对JA(茉莉素)、低温及稻瘟菌处理具有较强的响应表达变化。

广谱抗稻瘟病种质75-1-127的褐飞虱抗性基因鉴定及分子标记辅助选择育种

【目的】水稻品系75-1-127携带广谱抗稻瘟病基因Pi9,已被广泛应用于抗稻瘟病水稻品种改良。笔者育种实践发现75-1-127表现出较强的褐飞虱抗性,因此鉴定该品系中的褐飞虱抗性基因并进行分子辅助选择育种。【方法】根据水稻品系B5中褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15的序列,设计引物扩增75-1-127的基因组DNA,并对PCR产物进行测序分析。采用苗期集团法鉴定了75-1-127和B5的褐飞虱抗性表型。利用与Bph14与Bph15连锁的分子标记筛查了75-1-127为稻瘟病抗源回交转育的两系不育系后代,并鉴定了这些后代的稻瘟病抗性、褐飞虱抗性和主要农艺性状。【结果】75-1-127中含有与B5完全一致的Bph14和Bph15序列。75-1-127和B5苗期褐飞虱抗性均为1级。在以75-1-127为抗源改良的两系不育系中,携带Bph14、Bph15的单基因系或双基因系的褐飞虱抗性均得以改良,其中双基因聚合系的死苗率为8.5%,与供体亲本75-1-127以及阳性对照B5差异不显著,进一步证实75-1-127含有褐飞虱抗性基因。【结论】水稻品系75-1-127携带褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15,可以作为抗源应用于水稻褐飞虱抗性育种。

水稻抗稻瘟病基因Pi47的精细定位和候选基因分析

不断挖掘和克隆抗稻瘟病新基因,是解析水稻抗病分子遗传机制和培育抗稻瘟病新品种的重要基础。Pi47是笔者从广谱、持久抗稻瘟病湖南地方品种湘资3150中鉴定的稻瘟病抗性基因,前期研究将其初步定位于第11染色体标记RM224和RM5926间。本研究利用3个Pi47单基因系与感病亲本CO39杂交F2群体1687个感病单株对Pi47精细定位,利用6个STS标记对3个单基因系进行背景分析,采用生物信息学方法进行了候选基因分析。结果表明,Pi47被精细定位于CAPS标记S32与K33间0.24 c M区域的171.2 kb物理区间内,背景分析将Pi47进一步缩小至SC12和K33间67.8 kb的区间内;该区间含有8个结构基因,其中2个编码NBS-LRR抗病类似蛋白,为Pi47的候选功能基因。稻瘟菌抗谱比较分析发现,Pi47单基因系与其定位区间内4个Pik位点的等位基因Pik、Pikm、Pikh和Pikp的近等基因系抗谱不同。这些结果为进一步克隆Pi47和利用其进行分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品种奠定了基础。

水稻高收获指数不育系选育实践与展望

针对当前杂交水稻形势,介绍了水稻不育系的选育历史,总结了当前我国水稻不育系选育的困难及面临的主要问题,着重介绍了湖南农业大学新育成的卓201S、卓234S、展998S、南3502S等8个适合机械化制种的水稻小粒型两系不育系,选育的系列小粒不育系突出的特点是收获指数高;株型矮壮,叶片夹角小,生物产量适中;分蘖力强,成穗率高;茎秆坚韧,抗倒性好;异交特性好,结实率高。选配的系列高产优质杂交稻组合卓两优0985、卓两优141、南两优1998等组合表现高收获指数,高产稳产,适应性广,适合轻简栽培,且杂交制种产量高、种子质量好。通过系列高收获指数不育系的选育实践,以展998S为例总结了高收获指数不育系的生物学特征,并对今后高收获指数不育系的选育策略进行了探讨。

水稻DUF761基因家族成员鉴定与表达谱分析

DUF761家族是植物中一个未知功能结构域蛋白家族(DUF,domains of unknown function),其在水稻中的功能从未被探索。本研究通过生物信息学分析在水稻全基因组共鉴定到33个水稻DUF761基因家族成员。系统发育分析将这些成员分为3个亚家族。保守基序Motif-1分布于所有家族成员。在OsDUF761基因启动子区域共发现15种与胁迫响应、激素响应和发育相关的顺式作用元件。有30个基因的启动子区域含有ABRE元件(脱落酸响应),其中OsDUF761-21的启动子含有16个ABRE元件。组织表达谱检测结果表明,不同的OsDUF761基因成员在水稻中具有相似或者迥异的组织表达谱。在ABA、JA、低温、干旱和稻瘟菌分别处理水稻后,水稻中分别有12、13、24、24和18个OsDUF761基因的转录表达水平发生显著变化;其中,有8个基因在ABA处理和干旱处理后表现出共同的显著上调或者下调响应趋势;有6个基因在JA处理和稻瘟菌处理后表现出共同的响应趋势。本研究对水稻DUF761基因家族进行了全面分析,有助于进一步明确DUF761家族成员的生物学功能。

生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性

【目的】水稻粒形为多基因控制的复杂数量性状,同时影响稻谷产量和稻米外观及碾磨品质,挖掘粒形相关基因并解析其遗传机制,对于水稻高产和优质品种选育具有重要意义。【方法】以前期利用大粒籼稻品种特大籼(TDX)为供体亲本、小粒粳稻品种日本晴(Nipponbare,NPB)为轮回亲本获得的一个大粒近等基因系,在水稻第2染色体上初定位粒形调控基因GS2.2(grain size 2.2)的基础上,对GS2.2基因进行了精细定位和候选功能基因的克隆鉴定。【结果】利用BC4F2群体中2887份极小粒单株及该群体中70份基因型杂合的大粒单株自交获得的BC4F3群体,将GS2.2基因精细定位在2M-7-1与2M-9之间的160.6kb的区间内。该区间编码18个基因开放阅读框(ORF1-18)。测序发现ORF18基因在大粒近等基因系与小粒日本晴等位基因间存在5个SNP差异,ORF18编码生长素调控因子蛋白Os GRF4。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大粒近等基因系中ORF18进行敲除,发现ORF18敲除株系粒长变短,证实ORF18是GS2.2的功能基因。进一步对ORF18大粒近等基因系和基因编辑敲除株系进行稻瘟菌室内离体和病圃接种鉴定,发现ORF18大粒近等基因系稻瘟病抗性增强,而基因编辑敲除株系稻瘟病抗性减弱,表明ORF18正调控水稻稻瘟病抗性。【结论】本研究发现的生长素调控因子Os GRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性,为协调水稻高产和抗性育种提供了重要的基因资源。

水稻OsURGT1基因的生物信息学及表达谱分析

NSTs在细胞中负责将核苷酸单糖转运到高尔基体(Golgi)/内质网(ER)中,为细胞壁多糖分子的生物合成提供底物,水稻NSTs基因的研究将为深入了解植物NSTs蛋白的功能奠定良好基础。通过拟南芥AtURGT基因序列的同源比对,在水稻中发现了一个可能具有转运UDP-鼠李糖/UDP-半乳糖活性的基因,命名为OsURGT1(UDP-L-Rha/UDP-D-Gal transporters)。对其编码蛋白进行了氨基酸组成、进化关系、理化性质、跨膜结构域和高级结构的预测,对其启动子序列进行了顺式作用元件分析,同时还检测并分析了OsURGT1基因在水稻中的组织转录表达谱、激素及非生物胁迫处理诱导表达谱。结果显示:OsURGT1基因全长为3421 bp,含有5个外显子;CDS全长为996 bp,编码331个氨基酸长度的蛋白,此蛋白被预测是一个疏水性蛋白,含有9个跨膜结构域;蛋白高级结构建模结果表明,其与一个NST模板蛋白高度相似。基因启动子顺式作用元件分析结果表明,OsURGT1基因有可能参与多种激素调控途径和逆境胁迫调控途径。转录表达谱分析结果表明,OsURGT1基因在水稻整个生长发育时期和各个组织部位都有表达,在叶中的表达量相对最高;对6种激素(ABA、Eth、GA、SA、MeJA、2,4-D)处理皆有较强的响应表达;对干旱、低温、盐、氧化、高温、重金属等逆境胁迫也有不同程度的响应表达。综上可知,OsURGT1基因编码一个NST蛋白家族成员,并可能参与部分激素调控和逆境胁迫响应过程。

OsATG12基因负调控水稻稻瘟病抗性

自噬途径广泛参与调控植物生长发育、营养物质的循环利用、多种生物与非生物逆境的耐受性,但其在水稻中功能研究还处在初始阶段。本研究克隆了水稻自噬相关基因OsATG12的全长CDS,构建了OsATG12基因的超表达载体、基因编辑载体,进行水稻遗传转化后获得了相应的转基因水稻材料。对转基因材料进行阳性鉴定后获得了阳性转基因植株。对部分超表达转基因植株进行了OsATG12的表达量检测和繁种,获得了OsATG12超表达的转基因株系。对部分基因编辑转基因植株进行了靶位点基因型的检测和繁种,获得了atg12s突变体转基因株系。通过对这些转基因株系材料进行表型观察和稻瘟病抗性鉴定发现,atg12s纯合移码突变体植株均不能正常结实,且对稻瘟病的抗性增强;而OsATG12超表达转基因植株对稻瘟病的抗性减弱,说明OsATG12基因负调控水稻对稻瘟病的抗性,这为揭示水稻自噬途径及自噬相关基因的功能提供了新思路。

多重RT-PCR快速检测转基因油菜

全球转基因油菜的数量和种类日益增多,其所带来的潜在风险也备受人们的关注,迫切需要开发一套精准、高效、便捷检测转基因油菜的技术体系。本研究针对花椰菜花叶病毒35 S启动子(pCaMV 35S)、膦丝菌素乙酰转移酶(bar)、5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)3个目标基因的序列,以及油菜内源基因cruciferinA (CruA)序列设计四重实时荧光定量聚合酶链式反应(Multiplex real-time fluorescence quantitative,PCR)特异性强的引物和多重荧光探针。通过对多个转基因油菜材料验证,结果表明该方法检测特异性强,重复性好,4个基因的扩增效率都在90%~105%之间,标准曲线相关系数R2都大于0.99。转基因成分bar,epsps和pCaMV35S的检出限为0.1 ng/μL,内参基因CruA的检出限为0.01 ng/μL。本研究建立了一种能快速、高效、准确检测转基因油菜四重实时荧光定量PCR技术的检测体系。

水稻OsURGT2基因的克隆、表达及功能预测分析

植物细胞中核苷酸糖转运蛋白(NST)将胞质溶胶中的核苷酸单糖转运至高尔基体或内质网内,这对于植物细胞壁非纤维素多糖合成时单糖的供应至关重要。本研究从水稻中克隆了一个含有NST蛋白结构域的基因,命名为OsURGT2。对OsURGT2蛋白的理化性质、结构特点、基因启动子中的顺式作用元件及表达模式等进行了预测及分析。结果表明,水稻OsURGT2基因的全长编码序列为1008 bp,编码335个氨基酸。OsURGT2蛋白为疏水性蛋白,含有9个跨膜结构域和多个磷酸化位点,与一个GDP^(-)甘露糖转运蛋白的三级结构较相似。OsURGT2基因对高、低温和盐胁迫处理有较强的表达响应、受多种植物激素(赤霉素,水杨酸,茉莉酸甲酯)处理诱导表达。结果说明,OsURGT2极有可能编码一个具有某种核苷酸糖转运活性的蛋白,并可能在水稻生长发育过程中应答逆境方面发挥重要作用。

农科类硕士研究生培养的问题思考与若干建议

本文从生源质量、导师队伍层次、科研基础设施配备、培养模式等方面介绍了目前我国农科类硕士研究生培养存在的问题,并给出了若干建议,以期为我国农科类硕士研究生,尤其是非985、211工程高校农科类研究生的培养提供参考。

外源6-BA和BR对干旱胁迫下水稻分蘖期光合色素含量及抗氧化系统的影响

为明确6-苄氨基嘌呤(6-BA)和油菜素内酯(BR)对干旱胁迫下水稻分蘖期生理特性的调控机制,本研究以三系杂交中熟晚稻品种‘H优518’为试验材料,通过喷施25 mg/L 6-BA和BR溶液,研究其对干旱胁迫下水稻分蘖期光合色素含量、抗氧化酶活性、丙二醛含量及可溶性蛋白含量等的影响。结果表明,随着干旱胁迫加剧,水稻分蘖期生长受到明显抑制。喷施6-BA和BR溶液后,在干旱胁迫第9天的水稻分蘖期叶片总叶绿素含量和类胡萝卜素含量相比对照分别显著增加28.1%~32.66%和25.27%~27.47%,而抗氧化酶活性也受到不同程度的促进,丙二醛含量降低了19.99%~34.53%,可溶性蛋白含量增加了13.72%~23.04%,并且喷施6-BA溶液的整体效果要好于BR溶液。由此可见,叶面喷施6-BA和BR能有效缓解干旱胁迫对水稻分蘖期生理特性的影响,对水稻抗旱栽培具有重要意义。

水稻NCED基因家族生物信息学分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(简称NCED)作为高等植物ABA合成步骤的关键限速酶,其特征解析有助于对植物ABA合成的认识。通过生物信息学方法,从基本理化性质、二级结构、染色体定位、基因结构、蛋白质保守结构域、进化树、启动子顺式作用元件及表达模式等方面,对水稻NCED基因家族的结构和特征进行分析。结果表明,水稻NCED基因家族有5个成员,分布于第2、3、7、12号染色体上,均没有内含子,只由一个外显子组成;编码蛋白属于亲水性蛋白,无信号肽,含有典型的RPE65保守结构域,主要分布于叶绿体中,二级结构主要由无规则卷曲和延伸链组成,没有β-折叠结构;进化分析表明水稻与玉米的亲缘关系较近;顺式作用元件分析表明其可能受光、温度、氧气以及生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸等激素调控;NCED基因家族在水稻根和芽响应不同植物激素的表达量存在差异。本研究为水稻NCED基因家族成员的生物学功能研究提供理论依据。

低温贮藏对水稻种子活力及种胚显微结构的影响

为探明种子贮藏期间的劣变机理,以耐贮水稻品种‘望两优361’种子与不耐贮水稻品种‘黄两优091’种子为材料,通过对室温与低温贮藏条件下的种子活力、保护酶活性、膜透性及种胚显微结构的对比分析。结果表明,随着贮藏时间延长,种子活力、SOD、POD、CAT活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量下降,MDA含量和相对电导率增加,低温贮藏下的种子活力、SOD、POD、CAT活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量高于室温贮藏,而低温贮藏下的MDA含量和相对电导率则低于室温贮藏,‘望两优361’的种子活力、SOD、POD、CAT活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量的下降幅度与MDA含量、相对电导率的增加幅度小于‘黄两优091’,相关分析表明,SOD、POD、CAT活性与种子活力呈显著正相关,MDA含量、相对电导率与种子活力呈显著负相关。‘望两优361’种子在常温贮藏一年后胚部细胞排列紧密,细胞间隙小,胚细胞膜完整,而‘黄两优091’种子在常温贮藏下胚芽与胚根形态受到了影响,种胚与胚乳连接处的细胞排列较为紊乱,胚细胞膜不完整,部分细胞膜断裂。综上所述,低温贮藏下种子中能保持较高的保护酶活性,较低的MDA含量及相对电导率,有利于维持细胞膜结构的稳定,保持种子活力。本研究为水稻种子的安全贮藏提供理论依据。

MAS聚合Pi9和Pi49位点改良水稻两系不育系创5S稻瘟病抗性

为了改良水稻两系不育系创5S的稻瘟病抗性,分别以携带稻瘟病抗性基因Pi9位点(Pi9/Pigm/Pi2-1)的75-1-127、谷梅4号和天津野生稻以及携带Pi49位点的魔王谷为基因供体,通过回交转育和分子标记辅助选择技术,育成了包含单一抗性位点的创5S抗病单基因系;在此基础上,采用聚合杂交和分子标记辅助选择技术,培育了包含两个抗性位点的创5S抗病双基因聚合改良系。结果表明:携带单一抗性位点的改良不育系稻瘟病抗性显著增强,苗期发病级数显著低于受体亲本创5S;聚合2个抗性位点的改良系,较携带单一抗性位点的不育系稻瘟病抗性进一步增强、抗谱拓宽;部分改良不育系的株高、穗长、有效穗数、每穗总粒数、柱头外露率等农艺性状与创5S有显著差异。改良的系列抗病单基因系,可望用于配制稻瘟病抗性增强的两系杂交稻新组合;改良的抗病双基因聚合系,可在单基因系丧失抗性后应用于生产。

甘蓝型油菜BnaLPAT2基因克隆与生物信息学分析及载体构建

为进一步研究甘蓝型油菜BnaLPAT2基因,通过TAIR网站查找拟南芥AtLPAT2 (AT3G57650),在Brassica Database数据库检索到4条甘蓝型油菜LPAT2序列,据此设计引物,通过RT-PCR合成c DNA,得到4条CDS序列,其大小依次为1 173 bp、1 167 bp、1 173 bp、1 155 bp,分别命名为BnaLPAT2-1～BnaLPAT2-4。4个BnaLPAT2蛋白通过生物信息学预测分析显示:BnaLPAT2编码的氨基酸在384～390之间,理论分子量介于43 226.59～43 730.17 Da之间。甘蓝型油菜LPAT2蛋白的二级结构和跨膜区大致相同,均由LPLAT superfamily、PlsC superfamily、Acyltransf_C superfamily结构域组成,且具有较近的亲缘关系。从基因结构发现:4个BnaLPAT2均含有相同的外显子和内含子数,分别位于C08、A09、A07和A04染色体上。分析表明,克隆获得的4个甘蓝型油菜BnaLPAT2为该基因家族成员。为进一步研究甘蓝型油菜LPAT2基因的功能,我们通过双酶切技术,构建pBI121-LPAT2-napin载体,并转化根癌农杆菌GV3101。

MAS育种改良籼稻恢复系R747及其杂交种稻瘟病抗性

为了改良籼稻恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性,以携带广谱抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75-1-127为供体亲本,以R747为受体及轮回亲本,利用Pi9基因内功能标记,开展分子标记辅助选择育种实践。获得了如下主要结果:室内接种试验表明,75-1-127与R747对来自国内外不同稻区的24份稻瘟菌菌株的抗菌谱差异显著,抗性频率分别为91.7%和41.7%,两亲本在田间自然病圃苗瘟抗性表现分别为高抗和高感;根据Pi9基因序列信息开发了一个共显性多态标记SPL-1,该标记在75-1-127和R747基因组中分别扩增出一条745 bp和一条850 bp的条带,标记基因型对稻瘟病抗感表型的选择效率为100%;从BC6F3株系中遴选出一个高抗苗瘟的改良恢复系R747-Pi9,并用它与不育系培矮64S、P88S和桃1A分别配制出高抗稻瘟病的杂交种;利用分布于水稻全基因组不同位点的220个SSR标记,分析了改良抗病恢复系R747-Pi9与受体亲本R747的遗传背景差异,结果表明R747-Pi9对R747的背景回复率为0.94。本研究通过分子标记辅助选择和连续回交育种,成功定向改良了恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性。

水稻OsATG12基因的克隆、表达及生物信息学分析

ATG12蛋白参与调控植物体内自噬途径的发生,在自噬小体的形成过程中发挥重要作用。为研究水稻OsATG12基因的功能,本研究克隆到该基因的全长CDS序列,长度为282 bp,编码93个氨基酸。OsATG12为亲水性蛋白,具多个磷酸化位点,无跨膜结构和信号肽,预测定位于细胞质,具有APG12_C结构域。进化树分析表明该蛋白与短药野生稻的ATG12蛋白的亲缘关系最近。组织表达谱检测结果表明,在水稻幼苗中,OsATG12基因在根中表达量最高,在茎中基本不表达;在孕穗期水稻中,该基因在叶中的表达量最高,在茎、叶鞘中只有低水平的表达。高温、低温、盐、双氧水、PEG4000处理均能诱导该基因的表达。本研究为水稻OsATG12基因功能的进一步探索提供参考。

不同杂交组合白叶枯病抗性鉴定及遗传多样性分析

为提高抗白叶枯病新品种选育效率,减少育种的盲目性,本实验以87份杂交水稻品种为研究对象进行水稻白叶枯病鉴定,同时在基于SSR分子标记技术上进行遗传多样性分析。通过白叶枯病表型聚类和SSR分子标记聚类相结合方式进行分析,选择在抗白叶枯病方面具有优势的亲本。研究结果表明:在以优良不育系望S、粤禾丝苗、Y58S和优良恢复系R301、N111S为亲本的杂交水稻的白叶枯病的等级较低。在遗传多样性分析方面,筛选出36对具有多态性位点的SSR引物,分子量范围为90~200 bp;共扩增出118个等位基因,87份杂交稻品种在不同位点等位基因数目平均为3.3个,范围为2~6个,平均Nei’s基因多样性指数为0.452,变幅为0.096(SSR03)~0.764(SSR19)。亲本不育系望S、粤禾丝苗、Y58S和恢复系R301、N111S在选育抗白叶枯新品种时具有一定育种价值,可以为育种家选育抗白叶枯病新品种提供参考。

漆树TvFAD2基因的克隆与表达分析

植物油酸脱氢酶基因(FAD2)编码的蛋白是负责催化油酸转化为亚油酸的关键脂肪酸去饱和酶,在植物发育、油品质改良及耐逆过程中发挥重要调控作用。为了分离漆树FAD2基因并研究其功能,本研究采用同源克隆法首次从漆树中获得了FAD2基因的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明,TvFAD2基因的开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸,具有典型的脂肪酸去饱和酶结构域。TvFAD2为亲水性蛋白,含有5个跨膜结构域和3个富含组氨酸的保守区域。系统进化树分析表明,漆树FAD2蛋白和盐肤木FAD2蛋白的亲缘关系最近。转录表达水平检测结果表明,TvFAD2基因在主要在漆树的叶和幼果中表达,在幼果中表达量最高,在花蕾期全花和盛花期全花中有低水平的表达。本研究为漆树FAD2基因的进一步利用提供了理论指导。