猪Lck蛋白在猪圆环病毒2型体外复制过程中的作用

为了鉴定猪圆环病毒2型(PCV2)侵染细胞建立感染的重要宿主因子,本文分析在PK-15细胞中猪淋巴细胞特异性酪氨酸激酶Lck表达及活性对PCV2感染复制的影响,确定Lck是调控PCV2感染复制的新靶点。首先,本研究基于猪Lck结构特性和序列保守性分析,选取Lck SH3结构域为免疫原基因序列,利用原核表达目的蛋白制备小鼠抗猪Lck的多克隆抗体。然后,通过Western blot检测PCV2感染PK-15和3D4/21细胞后对Lck表达及活性的影响。最后,在PK-15细胞中利用瞬时转染过表达或Lck特异性抑制剂(A770041),通过Western blot和荧光定量PCR(RT-qPCR)检测猪Lck表达和磷酸化对PCV2复制的影响。结果显示,成功制备了鼠源性抗猪Lck的多克隆抗体。在PCV2感染PK-15和3D4/21细胞早期阶段,Lck表达水平未见明显变化,但Lck磷酸化水平显著上调。过表达Lck可显著上调PCV2 Cap蛋白表达及病毒拷贝数,而采用A770041抑制Lck磷酸化水平后,可显著下调PCV2 Cap蛋白表达、病毒拷贝数和病毒滴度,这些结果表明Lck正调控PCV2的感染复制,为发现PCV2感染的新分子机制奠定重要基础。

猪流产胎儿中猪圆环病毒3型的检测及其遗传演化分析

旨在分析猪流产胎儿中猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的感染及其遗传进化情况。对2015—2017年采集的湖南省680份猪流产胎儿病料样品进行PCV3检测、扩增和测序,并利用生物信息学软件对获得的序列进行遗传进化分析。结果显示,猪流产胎儿样品中PCV3阳性率为24.4%(166/680),其中,2015—2017年阳性率分别为18.2%(26/143)、22.7%(54/238)和28.8%(86/299)。从PCV3阳性样本中获得了1株PCV3基因组全长序列,命名为PCV3/CN/Hunan-57(GenBank序列登录号为MZ934695),与国内外毒株基因组序列相比,相似性为97.8%~99.2%;获得了5株PCV3 ORF2基因序列,它们的核苷酸和氨基酸相似性为97.5%~98.3%和96.7%~99.7%,与国内外参考毒株ORF2基因序列相比,其核苷酸和氨基酸相似性为96.3%~99.2%和96.8%~100%。基于ORF2基因序列构建遗传进化树和进行多重序列比对,发现获得的PCV3阳性序列分别属于PCV3a(1株)和PCV3c(4株),并鉴定出T100A、G113S和A184S突变位点。综上表明,猪流产胎儿中PCV3感染率较高,且存在不同类型的PCV3毒株感染,为后续深入研究PCV3遗传变异及其相关致病性提供了重要参考信息。

猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立与优化

为了能够同时检测猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)和猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3),试验根据国内报道的PCV-2和PCV-3毒株全基因序列设计6对特异性引物(P3~P8),并构建标准质粒进行引物特异性试验,然后通过优化扩增条件建立检测PCV-2和PCV-3混合感染的双重PCR方法。最后用PCV-2和PCV-3的感染性克隆同时转染PK-15细胞,盲传5代后用建立的双重PCR方法检测细胞培养液中的病毒核酸。结果表明:构建的PCV-2和PCV-3标准质粒浓度分别为290 ng/μL和380 ng/μL,双重PCR方法的最佳引物组合为P3/P6和P4/P8,最佳DNA聚合酶浓度为0.02 U/μL。使用引物组合P3/P6时,扩增得到的目的片段大小分别为308 bp和608 bp,最佳退火温度为58℃,最佳循环次数为28个;使用引物组合P4/P8时,扩增得到的目的片段大小分别为291 bp和645 bp,最佳退火温度为60℃,最佳循环次数为26个。运用建立好的双重PCR方法评估感染细胞模型,能有效鉴别PCV-2和PCV-3的单一感染和混合感染。说明优化得到的双重PCR检测方法可用于PCV-2和PCV-3的同时检测。

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体(m Ab),为PCV2免疫学诊断方法的建立和应用提供特异性抗体。首先通过原核大肠杆菌表达系统表达PCV2 Cap蛋白,将纯化后的Cap蛋白在体外组装成病毒样颗粒(VLPs),以VLPs作为免疫原免疫BALB/c小鼠,使用杂交瘤细胞技术筛选能稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步制备单抗腹水并纯化,通过Western-blot和IFA方法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。采用逐步截取法合成45条覆盖PCV2 Cap蛋白全长的短肽,并通过间接ELISA鉴定单克隆抗体识别的表位区域。利用两株mAbs对人工感染PCV2的猪肺脏组织进行免疫组化(IHC)检测鉴定。结果表明,成功筛选两株识别PCV2 Cap蛋白单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为1A6和1A8,其中1A6重链为Ig G2b亚型,1A8重链为Ig G1亚型,轻链均为κ链,纯化后的抗体效价均达1∶656 100。IFA结果显示,两株mAbs均能与PCV2感染的PK-15细胞发生特异性反应;Western-blot结果显示,两株mAbs均与PCV2 Cap蛋白发生特异性反应,且不与PCV3和PCV4 Cap蛋白发生交叉反应;所获抗体均识别PCV2 Cap蛋白C端211-225 aa肽段;IHC检测结果表明,两株mAbs均能与感染PCV2的临床样品发生特异性免疫反应。本研究成功获得了两株单克隆抗体1A6和1A8,均能识别PCV2 Cap蛋白,具有良好的特异性,为PCV2免疫学诊断方法的建立及Cap蛋白生物学功能研究提供了重要生物材料。

PEDV结构蛋白S和M在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒鉴定

为在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M蛋白,并探讨S和M蛋白能否自动组装成病毒样颗粒(VLPs)分泌至培养基中,本研究构建了3种不同的重组质粒(pFastBac-S、pFastBac-M和pFastBac-S-M),转化入DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定获得重组Bacmid,通过转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒(BV-S、BV-M和BV-S-M)。在悬浮培养的昆虫细胞Sf9中进行表达,表达分泌的上清通过蔗糖梯度离心进行浓缩纯化,最终获得分泌型的S-MVLPs。通过Western-blotting分析S和M蛋白的表达和分泌特性,透射电镜观察VLPs形态,间接ELISA检测VLPs与猪PEDV阳性血清的反应性,最后免疫小鼠后检验其免疫原性。结果显示,S和M蛋白均能以单独或共表达的形式(S-M)分泌至培养基中。电镜下可观察到由S-M蛋白形成的直径约为90~190 nm的VLPs。间接ELISA结果显示,S、M和S-M蛋白可与PEDV猪阳性血清发生特异性反应,免疫小鼠3次后可产生高水平特异性Ig G抗体。以上结果表明,在Sf9昆虫细胞中共表达S和M蛋白可以获得分泌型S-MVLPs,并具有良好的免疫原性。

猪圆环病毒遗传与宿主多样性研究进展

猪圆环病毒(Porcine circoviruses, PCV)是目前已知进化速率最快的单链DNA病毒之一,可分为4个基因型(PCV1~PCV4),其中PCV2进化速率达1.2×10^(-3)替代/位点/年,已接近RNA病毒。PCV4是新发现的基因型,与其他PCVs基因组的相似性为43.2%~51.5%。PCV1不具有致病性,其余基因型可感染各年龄段猪,引起具有多种临床表现的免疫抑制相关疾病,已成为制约当代养猪业发展的最重要因素之一。现有研究表明,PCVs不仅在猪群中广泛存在且有高度传染性,在反刍动物、啮齿动物、犬科动物、节肢动物和其他物种中被频繁检测出,具有跨物种传播的风险,需引起高度重视。为更深入地了解PCVs的进化及跨物种传播潜力,笔者总结了PCVs在不同物种中的检出情况及潜在传播途径,为揭示其进化、宿主适应性研究和防控策略提供参考。

Loop EF区嵌合猪细小病毒B细胞表位对猪圆环病毒2型病毒样颗粒组装的影响

Loop EF是猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的重要Loop结构,然而它在PCV2组装过程中的作用仍不清楚。本研究通过模拟PCV2病毒样颗粒(VLPs)3D结构,比较分析PCV2和PCV1、PCV3的氨基酸序列以及预测Loop EF的突变位点,筛选出PCV2 Loop EF中可供外源表位替换或插入的capsid表面位点,即第133位丙氨酸。探索性地针对该位点设计3个突变体,分别为猪细小病毒1型(PPV1)B细胞线性表位(228QQITDA233)插入PCV2 Cap第132和133位氨基酸、第133和134位氨基酸之间及替换第133位氨基酸。利用over-lap PCR等技术构建上述3个突变体的重组质粒,在大肠杆菌(BL21/DE3)中表达,并利用镍柱亲和层析纯化3个突变体蛋白,最后在体外进行VLPs组装,电镜结果显示3个突变体蛋白均可体外组装成完整的VLPs。结果表明,Loop EF中第133位丙氨酸的替换或插入外源表位突变不影响VLPs组装,提示PCV2 VLPs Loop EF展示外源抗原表位具有可行性。

噬菌体Qβ病毒样颗粒的制备、纯化及鉴定

目的:利用大肠杆菌原核表达系统制备噬菌体Qβ VLPs,验证其自组装能力,纯化后免疫动物以确定其免疫原性,同时制备兔多克隆抗体验证其在哺乳动物细胞中内化能力。方法:合成pET-28-Qβ -CP质粒,利用大肠杆菌原核表达系统制备Qβ VLPs,通过蔗糖密度梯度离心纯化VLPs,将经凝胶层析柱Sephacryl S-400纯化的Qβ VLPs用透射电镜观察颗粒形态;纯化后的Qβ VLPs加入或不加入佐剂分别免疫新西兰兔,获得血清后用Protein G纯化得到兔多克隆抗体,通过Western blot确定制备的兔多克隆抗体特异性,并利用间接免疫荧光法对Qβ VLPs的细胞内化能力进行鉴定。结果:制备并获得纯度较高的Qβ VLPs,通过透射电镜观察到大量直径约为28 nm的颗粒;Western blot结果表明制备的兔多克隆抗体能特异性识别Qβ VLPs,且在免疫实验中加入佐剂与不加入佐剂分别免疫动物,对抗体水平的影响不显著。间接免疫荧光法结果表明Qβ VLPs在哺乳动物细胞中具有内化能力。结论:成功制备Qβ VLPs为后续研发以噬菌体Qβ VLPs为载体的相关疫苗奠定基础。