枳NLP转录因子克隆及其在不同水分条件下的表达

【目的】分析柑橘砧木枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)参与氮素吸收与同化的重要转录因子NLP在干旱胁迫下的表达模式,为柑橘在干旱胁迫条件下对氮素吸收与同化的调控机理提供研究参考。【方法】以柑橘砧木枳为试验材料,在甜橙(Citrus sinensis(L.)Osb.)基因组数据库的基础上,利用生物信息学筛选获得甜橙NLP,并以此设计引物扩增枳NLP的CDS全长并测序。利用Clustal X和MEGA程序进行序列比对和系统发育分析,利用实时荧光定量PCR技术分析不同水分条件下的枳NLP的表达模式。【结果】筛选并克隆获得了4条枳NLP序列,为Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7和Pt NLP8。序列比对分析表明枳NLP之间的蛋白质序列一致性为45.13%,均具有明显的RWP-RK和PB1结构域。枳与甜橙的NLP蛋白质序列的一致性极高,分别为97.57%、96.47%、99.0%及97.33%。系统发育分析表明枳NLP可分为4个进化类型,与拟南芥的NLP分类一致,即Pt NLP2与At NLP1/2一类,Pt NLP4与At NLP4/5一类,Pt NLP7与At NLP6/7一类,Pt NLP8与At NLP8/9一类。在不同水分条件下,枳NLP的表达模式在叶与根中存在差异。随着基质水分含量的减少,枳叶NLP呈现先上升再下降的趋势。与对照(相对持水量为61.0%)相比,叶Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7及Pt NLP8的表达量在相对持水量为15.4%时上调至最高水平,分别上调了2.9、3.5、5.9及2.8倍,之后持续下调;到相对持水量为9.4%时,其表达水平低于对照但无显著差异。而枳根NLP的表达量在对照中最高,后随着水分的散失呈总体下降趋势且差异显著,与对照相比,根Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7及Pt NLP8的最大下调倍数分别为6.7、2.8、4.8及2.3。复水后,枳叶与根NLP的表达量低于复水前,且与对照差异显著。【结论】枳NLP的表达与土壤的水分条件密切相关。枳叶片NLP的表达水平在干旱胁迫前、中期上调,后期下调;而枳根NLP的表达水平在干旱胁迫下持续下调。其中,Pt NLP2和Pt NLP7的表达量在枳根响应干旱胁迫中变化较大。

冰糖橙与枸橼C-05对溃疡病菌生长特性的影响

【目的】采用新的接种方式,比较冰糖橙与枸橼C-05叶片对溃疡病菌生长特性的的影响,探讨冰糖橙与枸橼C-05对溃疡病菌敏感度的差异性。【方法】将完全展开、颜色淡绿的冰糖橙与枸橼C-05叶片进行75%酒精和1%Na Cl O消毒并切割后,分别与溃疡病菌在离体条件下共培养,观察叶片在MT培养基(对照)、MT中间嵌入NYGA培养基(MA)中对溃疡病菌生长的影响;分别提取冰糖橙和枸橼C-05叶片的粗提液,并以25%、50%和75%的比例添加至MT培养基中,观察冰糖橙和枸橼C-05叶片提取液分别对溃疡病菌生长的影响;同时以不同比例的叶片粗提液添加至NYGB培养基中,观察冰糖橙与枸橼C-05叶片提取液分别对溃疡病菌胞外多糖含量的影响。【结果】Xac在培养冰糖橙叶片的MT培养基中生长迅速,接种1周后即出现Xac的增殖现象,菌斑直径均值比对照大0.5 mm;接种2周后菌斑直径均值为5.27 mm,几乎是对照的3倍;而2—3周为Xac的急速生长期,菌斑直径由5.27 mm快速增长至13.41 mm,是对照菌斑直径的5倍多;3周后菌斑生长缓慢趋于平稳;各个时间点的菌斑直径与对照相比均达到极显著差异水平。在培养冰糖橙叶片的MA培养基中,Xac生长1 d后菌斑直径均值为4.58 mm,小于对照的6.19 mm;接种3 d后Xac继续生长,菌斑直径几乎与对照组相同,差异不显著;但是在接种5 d后,菌斑直径快速增长至21.31 mm,大于对照组的16.33 mm,3个菌斑长势连在一起,两者差异达到极显著水平。冰糖橙的叶片提取液对溃疡病菌的生长及胞外多糖含量均有促进作用,随着其添加浓度的增加,促进效果越明显,与对照相比均可达到极显著水平。Xac在培养枸橼C-05叶片的MT培养基中生长较为缓慢,在接种1周后菌斑直径与对照相比差异不显著;2周后菌斑直径约为对照的一半;3周时,菌斑直径均值为2.06 mm,小于对照的2.62mm;2周和3周时的菌斑直径与对照相比均达到显著水平。在培养枸橼C-05叶片的MA培养基中,Xac生长较为缓慢,菌斑直径均小于对照组,在1、3和5 d时与对照相比均达到极显著水平。枸橼C-05的叶片提取液对溃疡病菌生长和胞外多糖含量的影响不大,与对照相比均差异不显著。【结论】冰糖橙叶片中存在可促进溃疡病菌的生长、增加胞外多糖含量的物质,这种物质可能突破了其自身免疫系统,导致其对Xac高度敏感而极易感病。枸橼C-05叶片与溃疡病菌共培养时,分泌抑制溃疡病菌生长的物质,使得枸橼C-05对Xac具有较低敏感度而表现抗性。