枸橼C-05 CmPR4A上游转录因子CmWRKY75的筛选及其抗溃疡病功能分析

【背景】柑橘溃疡病(Citrus canker)是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonascitrisubsp.citri,Xcc)引起的危害严重的柑橘病害之一,目前尚无根治方法,而现有栽培品种中很少有对柑橘溃疡病存在显著抗性的品种,因此,抗病品种的选育对根治该病害尤其重要,而抗性基因的发掘又非常利于抗病育种。【目的】以枸橼C-05的抗溃疡病相关基因CmPR4A为诱饵,筛选其上游转录因子,探究转录因子参与调控枸橼C-05抗溃疡病的功能作用,为选育柑橘抗病品种提供基因信息。【方法】基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果,结合实时荧光定量PCR分析PR4A在抗病和感病种质中的表达差异,使用PlantCARE对枸橼C-05(抗病)和冰糖橙(感病)PR4A启动子序列进行差异分析,利用酵母单杂交筛选PR4A上游转录因子,并使用酵母回转验证、双荧光素酶验证CmPR4A和候选转录因子的互作关系。在8种抗病和感病柑橘种质中,人工接种Xcc后,于0、2、4、6和8 d时取注射点附近的叶片,对转录因子的表达水平进行分析,验证其与抗病的关系。通过农杆菌介导瞬时转化法,将带有35S启动子的转录因子载体在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达,使用qRT-PCR对转录因子和PR4A表达水平进行分析,并在瞬时过表达24 h后接种Xcc,进行Xcc菌定量和症状观察。【结果】接种Xcc的枸橼C-05和冰糖橙的转录组分析及定量PCR表达结果显示,在接种4、6和8 d时,抗病种质枸橼C-05中的PR4A表达量显著高于感病的冰糖橙。枸橼C-05和冰糖橙的PR4A启动子在-236bp处存在顺式作用元件W-box的差异,以此为依据进行CmPR4A启动子短截并构建诱饵载体。依据自激活结果,在200 ng·mL-1的金担子素(AbA)浓度下,以proCmPR4A-2为诱饵,在枸橼C-05受Xcc诱导下的酵母文库中进行酵母单杂交筛选,表明CmWRKY75可以与proCmPR4A-2互作,双荧光素酶报告系统也证实二者的互作关系,且CmWRKY75正调控CmPR4A的表达。在8种柑橘种质叶片接种Xcc后进行WRKY75的表达模式分析表明,WRKY75表达量在抗病种质枸橼C-05、美国枸橼AV、矮果香橼中显著上调,在感病种质冰糖橙、沙田柚及柠檬、南川香橼和丹娜香橼中只出现微量上调。在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达WRKY75,发现PR4A的表达量在接种4d时显著上调且能增强叶片对Xcc的抗性。【结论】CmWRKY75可以结合到CmPR4A启动子的W-box上,并正调控CmPR4A的表达,增强叶片对Xcc的抗性。同时WRKY75的表达受Xcc诱导,在抗病种质中呈显著上调表达,与PR4A在抗病感种质中的表达变化趋势一致,可能是上游调控因子WRKY75在不同抗病和感病柑橘种质中表达差异导致,从而使其在枸橼C-05抗溃疡病过程中起作用。