幽门螺杆菌VacA N端在巨噬细胞中表达对其细胞因子分泌功能的影响

构建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体,研究幽门螺杆菌空泡毒素单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞细胞因子分泌的影响。PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,Western blot和荧光显微镜鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄入法观察巨噬细胞的空泡样变;ELISA法检测巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β含量。重组质粒转染THP-1巨噬细胞24h,部分细胞胞浆中出现大小不等的空泡,且重组质粒组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)下调细胞因子的分泌。结果显示,成功构建pDsRed-Monomer-C1/vacA真核表达载体;VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β;核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌。

esp基因存在与粪肠球菌耐药的相关性分析

目的研究粪肠球菌临床株表面蛋白基因(esp)的流行情况及esp基因存在状况与粪肠球菌耐药的相关性。方法用PCR法扩增粪肠球菌esp基因并克隆、测序;用琼脂稀释法检测5种常用抗菌药物对粪肠球菌临床株的最低抑菌浓度(MIC)。结果61株粪肠球菌中,esp基因阳性率为42.6%;氨苄西林、环丙沙星、高浓度庆大霉素MIC>500 mg/L,红霉素耐药粪肠球菌中,esp阳性率分别为33.3%、54.8%、70.6%、51.0%;敏感株中esp阳性率分别为43.6%、30.0%、7.4%、8.3%。结论esp基因的存在状况与粪肠球菌对氨苄西林耐药无明显相关性,而与环丙沙星、红霉素、高浓度庆大霉素耐药有显著相关性;esp基因有可能成为粪肠球菌耐药株的分子表面标志物。

日本血吸虫149个表达序列标签和18个全长cDNA的获取和分析

目的从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列,为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,将获取的表达序列标签(ExpressedSequenceTag,EST)登录GenBank;对某些感兴趣的序列进行步移法测序获取全长cDNA,并进行生物信息学分析和登录。结果随机挑取382个阳性克隆进行测序,获得149个EST,同源性比较发现,部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。共获取18个日本血吸虫全长cDNA,大部分为管家基因,其中部分可作为日本血吸虫的候选疫苗分析和药物靶点。结论EST技术有助于快速、经济地获取日本血吸虫表达序列。

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在HeLa细胞中的表达

构建日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶基因核酸疫苗,PCR、双酶切和DNA序列鉴定后,运用电穿孔技术将重组体pcDNA3.1(+)/Sjcb2转染Hela细胞,免疫细胞化学检测其能在HeLa细胞浆内表达,为抗日本血吸虫核酸疫苗的研制打基础。

日本血吸虫普遍性结合酶E基因的获得和分析

目的 从日本血吸虫 (Schistosoma japonicum)成虫 c DN A文库中获得并分析日本血吸虫新基因 ,为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点。方法 构建日本血吸虫成虫 c DN A文库 ,随机挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取全长 c DN A,登录 Gen Bank,利用 BL AST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较 ;并利用 pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果 获得了 1个日本血吸虫新基因普遍性结合酶 E基因(ubiquitin- conjugating enzyme E,AY2 5 16 0 8) ,长 85 4 bp,编码 14 9个氨基酸 ,与人类普遍性结合酶 E具有 5 5的同源性 ,编码蛋白的理论分子量为 7.14 98k Da,等电点为 8.0 1;抗原表位可能位于氨基酸序列 373～ 396处。结论 步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因。

SARS冠状病毒S1蛋白的原核表达与鉴定

目的 克隆SARS冠状病毒 (SARS-CoV)S1基因片段 ,构建原核表达载体 ,并在宿主菌中诱导表达带组氨酸标记的融合蛋白。方法 人工合成SARS-CoVS1基因片段 ,克隆至pUCm T载体 ,经DNA序列分析和酶切后 ,将酶切片段亚克隆至原核表达载体 pET - 2 8b(+) ,重组子pET 2 8b/SARS S1转化大肠杆菌ril,IPTG诱导表达 ,Westernblot鉴定表达产物 ;纯化表达产物并用ELISA检测其抗原特异性。结果 获得了主要以包涵体形式存在的 32kD的目的蛋白 ,Westernblot鉴定其为带组氨酸标记的融合蛋白 ,ELISA证明其能与合成肽的抗体及病人血清中的SARS-CoV的抗体特异结合。结论 成功构建了SARS-CoVS1基因的组氨酸标记表达载体 pET-2 8b/SARS-S1,并在ril中得到了高效表达 ;表达的S1蛋白具有较好的抗原特异性 ,便于免疫动物以获得特异抗体 。

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达(英文)

目的克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBC SK+/Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段,重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后,运用电穿孔技术将重组体pcDNA3.1(+)/Sjcb2转染HeLa细胞,间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗;重组质粒在HeLa细胞中获得表达。结论Sjcb2基因能够在体外真核细胞中表达。

GST-hDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定

目的 构建GST hDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GST hDaxx融合蛋白 ,并研究其与 p5 3的结合能力。方法 构建GST hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX 4T/hDaxx ,在大肠杆菌 (E .col i)中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后 ,Westernblot鉴定表达产物与纯化物。通过共免疫沉淀反应与Westernblot观察hDaxx与p5 3的结合反应。结果 在原核细胞中成功表达了GST hDaxx融合蛋白 ,hDaxx与 p5 3可发生共免疫沉淀反应。 结论 1.GST hDaxx融合蛋白成功表达 ;2 .hDaxx和 p5 3的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关。

Sjcb2基因原核表达载体的构建及表达

目的探讨日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)中国大陆株(Chinese strain)组织蛋白酶B肽链内切酶基因(Cathepsin B endopeptidase)的原核表达载体pWR450-1的构建及表达情况。方法根据Genbank中Cathepsin B en-dopeptidase全序列(Genbank登录号为AY226984)设计特异性引物应用聚合酶链反应技术扩增基因全长,克隆入pUCm-T载体,酶切后亚克隆入原核表达载体pWR450-1并进行表达;利用SDS-PAGE及Western blotting观察日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶表达情况。结果成功构建了Sjcb2/pWR450-1原核表达重组质粒,该重组质粒在大肠杆菌中可经IPTG诱导表达分子量约为86kD的融合蛋白,Western blotting分析表明,该融合蛋白能被兔阳性血清所识别。结论日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶可在原核表达载体pWR450-1中表达,为研究其功能打下了必要的基础。

67例静脉置管培养阳性的分析与临床对策

目的分析静脉导管培养的阳性结果及临床对策。方法用回顾性调查的方法对67例静脉导管培养阳性的结果进行分析。结果最常见的病原体为凝固酶阴性的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌,大多数细菌都表现出较强的耐药性,革兰阳性菌最敏感的药物为万古霉素,革兰阴性菌最敏感的药物为碳青霉烯类抗生素。结论对疑似血管内导管相关性血流感染(CRBSI)的病患给以正确的标本留取方案,培养结果结合临床资料,综合分析为临床及时确诊和治疗中的合理用药提供依据。

Livin的siRNA对胃癌细胞BGC823生长与功能影响的初步研究

目的:观察livin基因的siRNA对人胃癌细胞株BGC823生长与功能的影响。方法:构建针对livin基因siR-NA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-livin,通过脂质体介导转染至BGC823细胞,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法分别检测livin基因mRNA和蛋白表达,激酶活性检测试剂盒检测胱冬肽酶-3(Caspase-3)的活性,MTT法分别检测PBMC和BGC823细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测混合细胞培养上清中TNF-α分泌量的变化。结果:转染48 h实验组细胞livin mRNA和蛋白表达水平明显受到抑制,表达抑制率分别为64.63%和62.80%,P<0.05;Caspase-3活性增强,细胞凋亡率为22.4%,P<0.05;PBMC和BGC823细胞增殖减慢;细胞培养上清中TNF-α分泌量明显降低,P<0.05。结论:通过抑制BGC823细胞中livin的表达,Caspase-3的活性增加,从而诱导细胞凋亡率上升;livin基因表达沉默可以抑制PBMC细胞增殖,TNF-α分泌减少,提示了livin基因可能是在细胞发生癌变初期过度表达的一个凋亡抑制基因。

白细胞介素-17与幽门螺杆菌感染所致胃疾病的相关性研究

幽门螺杆菌（Hp）是导致人类发生慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌,并且与胃腺癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生也密切相关.Hp诱导产生的白细胞介素-17（IL-17）作为第二信使招致粒细胞在局部聚集,是引起胃部炎症反应以及进一步病理损害的重要调节因子.在Hp感染性胃疾病中,胃粘膜中的IL-17蛋白表达明显增加.

rhIL-24蛋白诱导THP-1细胞分泌炎症性因子和肿瘤细胞凋亡作用的研究

目的:探讨rhIL-24蛋白诱导THP-1细胞分泌炎症性因子和肿瘤细胞凋亡的意义,为临床肿瘤的基因治疗奠定基础。方法:RT-PCR扩增人源性成熟肽IL-24基因,构建重组质粒pQE30/hIL-24,在大肠埃希菌M15中表达重组蛋白。SDS-PAGE和蛋白质印迹法对表达的产物鉴定,镍-琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白,尿素梯度透析法复性,ELISA法和FCM法检测rhIL-24蛋白诱导THP-1细胞分泌IL-6、TNF-α炎症性细胞因子和THP-1凋亡。结果:在大肠埃希菌中表达的rhIL-24蛋白与预期值相一致。纯化并复性后的rhIL-24蛋白能诱导THP-1分泌炎症性因子,蛋白浓度28μg/mL作用THP-1细胞,细胞因子的分泌量达到峰值,rhIL-24蛋白作用THP-1细胞18h,分泌量达到峰值。THP-1细胞随着rhIL-24浓度的增加凋亡率不断增加,28μg/mL达到峰值。结论:rhIL-24蛋白诱导THP-1分泌炎症性因子和细胞凋亡,说明rhIL-24诱导肿瘤细胞凋亡和免疫刺激抗肿瘤的协同效应得到验证。

核酸疫苗与蛋白疫苗的免疫特点及其联合免疫的研究进展

核酸疫苗和蛋白疫苗具有各自的免疫特点，分别诱导以细胞免疫和体液免疫为主的免疫应答，并能通过联合免疫提高机体预防病原体的免疫保护力，而核酸疫苗和蛋白疫苗的免疫特点以及联合使用核酸疫苗与蛋白疫苗协同免疫可以提高疫苗免疫效果。

鹦鹉热嗜衣原体禽鸟株的分离鉴定及小鼠呼吸道感染模型的建立

【目的】优化鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,C.psittaci,Cps)禽鸟株分离培养技术,建立Cps呼吸道感染的小鼠模型。【方法】从禽鸟肝组织中抽提总DNA,PCR法体外扩增Cps ompA基因,初步鉴定Cps阳性标本;同时将阳性标本的肝组织匀浆液接种到HeLa和Vero细胞中培养,Giemsa和免疫荧光染色法鉴定衣原体包涵体。将临床株扩大培养后,用2×104、2×105、2×106 IFU三个剂量鼻内接种小鼠,分别于感染后5 d和10 d处死小鼠,显微镜观察受染小鼠各脏器病理变化。【结果】采用PCR扩增Cps ompA基因,从100只禽鸟标本中检测到阳性Cps标本6例(6%),并成功地在HeLa及Vero细胞中培养出3例,且Vero细胞内的衣原体包涵体体积大,结构致密,对衣原体感染引起的宿主细胞溶解耐受性较HeLa细胞强,更适合用于Cps的分离培养及体外研究。成功建立Cps的鼠呼吸道感染模型,105 IFU是建立Cps呼吸道感染小鼠模型的适宜菌量。【结论】优化了Cps禽鸟株的分离培养技术,成功建立了Cps呼吸道感染小鼠模型,为Cps流行病学调查及研究衣原体的致病性和致病机制奠定基础。

壳聚糖在黏膜免疫中的应用

目的黏膜免疫可以诱导有效的黏膜和系统免疫反应，从而保护黏膜表面，是防止病原体在黏膜表面克隆并入侵的关键。但黏膜接种疫苗吸收效率低，黏膜免疫效果往往不理想，因此需要添加有效的黏膜免疫佐剂和载体系统来提高疫苗的效果。壳聚糖是一种被广泛应用的天然聚合物，无毒，具有生物粘附性和免疫调节作用，在黏膜免疫中作为佐剂和载体得到大量应用。

IL-24基因与肿瘤免疫治疗

白细胞介素-24(IL-24)又称为黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7),它主要由CD3+ T淋巴细胞和单核细胞表达,为分泌蛋白,由206个氨基酸组成,属于IL-10家族成员。IL-24是第1个被报道的具有白介素作用的肿瘤抑制分子,具有选择性的广谱抗肿瘤活性。IL-24基因通过抑制血管形成、激活生长抑制和DNA损伤基因(GADD)等信号传导途径,抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无明显影响。INGN241是一种新开发的基因治疗制剂,对多种肿瘤具有抑制和治疗作用。