花旗松素对H9C2细胞氧化应激保护作用机制研究

背景氧化应激(OS)与缺血性心脏病(IHD)的发生发展密切相关,抗OS损伤在IHD防治中至关重要。花旗松素(Tax)具有抗炎、抗肿瘤、抗OS作用,但其抗OS机制尚未完全明了。目的探讨Tax对过氧化氢(H_2O_2)诱导的H9C2心肌细胞OS损伤的保护机制,为OS损伤性疾病的新药研发提供基础依据。方法 2017年3月—2018年3月,将H9C2细胞随机分为对照组〔仅加入0.1%二甲基亚砜(DMSO)〕、H_2O_2处理组(加入200μmol/ml H_2O_2处理12 h)、Tax+H_2O_2处理组(加入100μmol/ml Tax预处理6 h,换液后加入200μmol/ml H_2O_2处理12 h)、Tax处理组(加入100μmol/ml Tax处理6 h)。对于对照组、H_2O_2处理组、Tax+H_2O_2处理组,采用光学显微镜观察细胞形态,荧光倒置显微镜观察细胞染色情况,RT-PCR法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、骨桥蛋白(OPN)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)mRNA表达水平。采用Western blotting法检测对照组、Tax处理组丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路p38、磷酸化p38(p-p38)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK(p-ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)表达水平。结果与对照组相比,H_2O_2处理组细胞出现肥大,呈圆形及不规则形状,而Tax+H_2O_2处理组细胞形态接近梭形,细胞变圆及肥大程度较H_2O_2处理组轻,不规则形态细胞数量减少。H_2O_2处理组绿色荧光量较对照组明显增多且亮度增强,而Tax+H_2O_2处理组较H_2O_2处理组绿色荧光量及亮度减弱。Tax+H_2O_2处理组iNOS mRNA、OPN mRNA表达水平低于对照组、H_2O_2处理组(P<0.05);Tax+H_2O_2处理组HMGB1 mRNA表达水平高于对照组、H_2O_2处理组(P<0.05)。Tax处理组MAPK信号通路p38表达水平低于对照组,p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表达水平高于对照组(P<0.05)。结论 Tax可以改善H_2O_2对细胞造成的形态学改变并减少细胞内OS水平,其机制可能通过激活MAPK信号通路,激活HMGB1表达,抑制OS相关基因iNOS、OPN的表达来发挥抗OS作用。

Txt5腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达

设计小鼠Txt5基因的特异性引物,将小鼠c DNA作为模板,用PCR扩增出m Txt5编码区,并加入HA标签序列.将这一片段插入p MD-18T载体,再亚克隆至p Adtrack-cmv穿梭载体上.线性化后,转化BJ5183感受态细胞,在BJ5183中发生同源重组获得p Ad-Txt5质粒.p Ad-Txt5线性化后转染293A细胞,包装得到含Txt5基因的病毒.将病毒溶液感染大鼠原代心肌细胞,一段时间后观察绿色荧光,然后通过RT-PCR和免疫印迹法检测HA标签蛋白的表达.结果表明成功构建小鼠Txt5腺病毒表达载体并实现在大鼠原代心肌细胞中的表达.