人心脏发育候选基因hole在MAPK信号传导途径中的作用

MAPK信号传导途径是存在于真核细胞中的最广泛的一种调节机制,它与心血管的发育、心肌肥大等心脏疾病的发生有着密切的关系。利用荧光素酶的活性分析讨论人hole基因在MAPK信号途径中的作用。实验表明,COS-7细胞中过表达hole蛋白能够强烈抑制MAPK信号途径的2个下游转录因子AP-1和SRE的转录活性。hole的突变体报道基因分析表明,hole基因可能是通过其N′端的ERK结合区和C′端的多聚脯氨酸序列来行使其抑制作用的。研究表明,该基因可能通过参与MAPK信号途径而在心脏发育的过程中起作用。

心脏发育和疾病的表观遗传调控机制

表观遗传调控机制是后基因组时代的重点研究领域,当前许多证据表明表观遗传学调控心脏发育进程,参与多种心脏疾病的调控。本文综述了DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物和microRNAs在心脏发育中的作用,以及在动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌缺血、心肌纤维化等心脏疾病中表观遗传调控的研究进展,同时概述了生物活性食品化合物在心脏保护中的作用,为心脏发育的分子机制研究和心脏疾病的预防与治疗方向提供新的视角。

流感病毒影响大鼠胚胎心脏发育机制的初步探究

先天性心脏病(先心病)是新生儿第一大出生缺陷,其中主因素有遗传因素、环境因素,但更多的是两者的相互作用。诱发先心病发生的环境因素复杂多样,但是具体的致病机制还有待阐明。研究表明孕母体早期感染流感病毒后,胎儿出现心血管畸形的概率显著增加,但其分子机制尚不明确。为了揭示流感病毒宫内感染和先天性心脏缺陷之间的关系,本实验利用F344 大鼠建立了流感病毒宫内感染的动物模型,观察了感染流感病毒后孕鼠胚胎的发育,并利用荧光定量PCR 检测了调控大鼠胚胎心脏发育的关键基因的表达。结果表明,流感病毒感染孕鼠后延迟鼠的胚胎发育,导致胚胎心脏发育异常。同时,胚胎心脏发育的关键基因骨形成蛋白4 (bone morphogeneticprotein 4, BMP4)、成纤维细胞生长因子12 (fibroblast growth factor 12, FGF12)、包含氧化还原酶的WW 域(WW domain-containing oxidoreductase,WWOX)、盘状结构域受体2 (discoidin domain-containing receptor 2, DDR2)和乙型肾上腺素受体3 (Ephrin type-B receptor 3, EPHB3)的表达下调,且均具有统计学差异。本研究初步证明流感病毒可能通过抑制胚胎心脏发育相关基因的表达,影响胚胎心脏发育过程,致使先心病的发生。

心脏发育候选基因PYGO1 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER-PYGO1)。首先,针对PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSU-PER质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSU-PER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此,靶向PYGO1的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。

建立果蝇心脏发育候选基因CG3295的基因敲除系

果蝇CG3295基因是哺乳动物基因RMND5在果蝇中的同源物,其功能未知.利用P转座子敲除技术进行果蝇CG3295基因的敲除研究,将果蝇14234系的P转座子与Δ2-3系中的转座酶基因组合到同一个体,使P转座子在体内敲掉目的基因.从后代挑选不含P转座子和转座酶基因的500头雄蝇分别与缺失了CG3295基因的测交系交配,从后代筛选获得20个CG3295基因敲除候选系.进一步利用Hand-GFP系使候选系的心脏表达绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下根据候选系是否表现心脏突变表型鉴定敲除系,最后获得了12个表现心脏突变表型的CG3295基因敲除系.

果蝇心脏发育标记基因Svp的多克隆抗体制备

研究果蝇的心脏发育基因表达调控机制,其相应靶点的抗体必不可少。但目前市场上缺乏此类商用抗体,因此本研究选择果蝇心脏发育中的标记基因Svp(Seven-up),并采用DNA免疫技术来快速制备其抗体。首先通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出Svp基因编码区部分序列,然后将其连接到真核表达载体pCAGGS-P7上,再将重组质粒pCAGGS-P7-Svp直接注射进小鼠体内,使外源基因在活体内表达,产生的抗原激活了小鼠的特异性细胞免疫和体液免疫,从而分泌相应的抗体,取小鼠的血清收集获得抗体。最后用蛋白质印迹(Western blot)和胚胎免疫荧光技术检测Svp抗体的效价和特异性。结果表明,制备的Svp多克隆抗体具有高效价和特异性,为后续的果蝇心脏发育研究奠定了基础。

果蝇心脏发育标记基因Lbe抗体的制备与应用

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的心脏发育调控基因与人类的相关基因具有高度同源性。Lbe基因是果蝇心脏发育的重要调控基因。为了深入研究Lbe基因在心脏发育中的调控功能,采用DNA免疫技术制备了抗果蝇Lbe蛋白的多克隆抗体。通过PCR扩增Lbe基因序列,将该序列与真核表达载体pCAGGS-P7同源重组,以该同源重组载体免疫4周龄小鼠,获得含有抗Lbe多克隆抗体的血清。蛋白质印迹(Western blot)和胚胎抗体染色结果表明,该抗体的特异性较好。该抗体为随后的Lbe功能的研究奠定了基础。

非病毒纳米载体递送CRISPR/Cas9的研究进展

成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)技术目前广泛应用于生命医学领域的基础研究及临床应用研究。由于载体在CRISPR/Cas9技术中发挥了重要的作用,如何进一步开发和优化载体系统具有重要的意义。传统的载体大多以病毒载体为主,其递送的效率高,但亦存在插入片段的大小有限、免疫反应、致癌、难以大规模生产甚至脱靶等缺陷;而非病毒纳米载体在一定程度上可解决基因编辑过程中由病毒载体所带来的潜在毒性和容量限制等问题,可能具有更广阔的应用前景。本文主要综述了目前用于CRISPR/Cas9系统递送的非病毒纳米载体,探讨了非病毒纳米载体在递送CRISPR/Cas9系统时可能遇到的主要困难,提出了相应的解决方案和策略,以期为基因治疗和药物研发提供新的参考依据。

人类心发育候选基因ZNF569融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的：构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569，并鉴定其在哺乳动物COS-7细胞系能否正确表达。方法：把ZNF569基因ORF定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569，脂质体介导将pEGFP-ZNF569转染入哺乳动物COS-7细胞，以一步法RT-PCR检测其在哺乳动物COS-7细胞中的表达情况。结果：双酶切及测序鉴定表明成功构建真核表达重组体pEGFP—ZNF569，并在COS-7细胞中成功地表达了融合荧光蛋白。RT-PCR检测显示RT—PCR扩增产物与ZNF569目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的mRNA。结论：真核表达重组体pEGFP-ZNF569的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究ZNF569在心发育过程中的信号调控奠定了一定的实验基础。

致癌超级增强子的形成与干预研究进展

超级增强子是一种能促进高效转录的大片段复合增强子,由多个普通增强子组成,结合有大量的转录因子、中介体复合物及染色质调节因子。癌细胞基因组若发生插入、缺失、易位和重排,可能会产生新的超级增强子,从而驱动癌基因过表达,这种超级增强子被称为致癌超级增强子。据报道,多种肿瘤涉及的致癌基因和信号途径都受到超级增强子的严格调控,提示针对超级增强子的抑制剂可能在癌症治疗中具有潜在作用。本文综述了超级增强子的结构和鉴定、致癌超级增强子的形成和相关信号通路及其小分子抑制剂干预的研究进展,可为理解肿瘤发生机理和治疗提供新视角、新机遇。

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.

斑马鱼心脏标记基因pitx2的多克隆抗体的制备

pitx2基因是一类bicoid相关的同源异型框因子成员,介导心脏左右不对称发育和内脏器官的偏侧化.pitx2基因位于Nodal信号途径的下游,直接由Nodal信号分子控制.用PCR技术扩增斑马鱼pitx2基因的部分编码区,并将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒(pGEX-4T-1-pitx2)转入BL21感受态细胞,通过IPTG诱导表达融合蛋白,用GST珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体.获得了pitx2原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗pitx2多克隆抗体.提取斑马鱼不同器官和组织蛋白,用自制的多克隆抗体检测pitx2基因在斑马鱼中的表达情况,发现pitx2基因特异性地在心脏、脑、肌肉、小肠和肝脏表达,尤其在心脏中有很高的表达,表明制备的抗体特异性非常好.

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。

CRISPR/Cas9系统对斑马鱼fhl1a基因敲除有效性的研究

为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用,利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl1a基因的三号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体.将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中以期实现对目的靶基因fhl1a的敲除.随后收集部分72 h胚胎进行PCR检测和产物直接测序,确定有无突变.为进一步验证突变是否可稳定遗传,选择具有敲除了的F_0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F_1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析.结果显示F_1获得了不同程度的插入、缺失等突变类型.研究结果证明所设计的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系统能在斑马鱼体内有效地形成基因突变,该突变能稳定地遗传到下一代个体,这为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的具体调控机制打下了基础.

果蝇新基因CG7609的克隆与初步功能研究

通过生物信息学方法和分子克隆技术克隆了一个果蝇新基因CG7609.该基因属于WD40家族,具有7个典型的WD40重复结构域,与人类WDR24基因的同源度很高.胚胎原位杂交和RT-PCR显示其在胚胎早期的中胚层有弱表达,在胚胎晚期主要在肠中表达.通过心脏特异抗体检测CG7609突变体的表型,发现其心脏前体细胞的分化不受影响.但通过果蝇心力衰竭模型分析该基因在成体心脏中的功能,发现CG7609基因缺失后心力衰竭发生率明显高于野生型,而且在与pannier基因配对后心力衰竭率发生较大的变化,这个初步发现推测该基因可能在成体心脏中具有功能.

svp基因在果蝇副心肌细胞生长中的作用(英文)

果蝇心脏位于身体背部,是一个体节性重复的线性管状结构。在hedgehog(hh)基因的信号诱导下,seven-up(svp) 基因调控果蝇的心脏发育,在每个体节的两个心肌细胞和两个副心肌细胞中表达。结果表明,在svp纯合突变体中,报告 基因lacZ存心肌细胞中的表达图式正常,但在副心肌细胞中的表达图型明显异常,而且部分EPC细胞生长尺寸增加。某 些体节的DA1肌肉祖细胞缺失,晚期突变体胚胎体壁肌肉细胞也呈现异常,表明基因svp的活性对果蝇副心肌细胞、DA1 肌肉祖细胞和体壁肌肉细胞的分化是必须的,并且可能与EPC副心肌细胞的尺寸生长有关。

稳定过表达人KLHL31基因的H9c2细胞系的建立及鉴定

人类KLHL31基因是本实验室已克隆的基因,其蛋白质含有保守的BTB和串连重复的Kelch结构域,实验表明人类KLHL31在成体骨骼肌和心肌组织中特异表达,KLHL31蛋白的过表达可以抑制了AP-1与SRE的活性。本文拟利用阳离子聚合物转染技术将重组表达质粒pCMV-tag2B-KLHL31转染H9c2细胞,通过G418筛选,RT-PCR和Western blotting验证,建立稳定过表达KLHL31基因的细胞系H9c2-KLHL31,为研究KLHL31在心脏发育及其相关功能提供有用的细胞研究模型。

BAI1基因敲除打靶载体的快速构建

BAI1(脑血管生成抑制因子1)因其具有抑制血管生成的作用而得名,研究表明肿瘤的发生可能与BAI1的低表达有关.为了进一步探索BAI1的作用机制,运用改良的Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50 bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了BAI1基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,为后续的构建BAI1基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因功能奠定了基础.

花旗松素对过氧化氢诱导H9C2细胞焦亡的保护作用

目的:探讨花旗松素(taxifolin)对大鼠心肌细胞株H9C2氧化损伤后焦亡的影响及其相关分子机制。方法:将体外培养的H9C2细胞分为对照组、H_2O_2处理组和taxifolin+H_2O_2处理组。倒置相差显微镜观察各组细胞形态;JC-1染色和流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位;线粒体绿色荧光探针(mito-tracker green)法检测线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的变化;Western印迹检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)蛋白表达水平;反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测细胞中白介素-18(interleukin-18,IL-18)、白介素-1a(interleukin-1a,IL-1a)、白介素-1b(interleukin-1b,IL-1b)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)、凋亡相关微粒样蛋白(apoptosis-associated apeck-like protein,ASC)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体样蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)和核苷酸结合寡聚化结构域受体家族半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶募集域蛋白质4(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family caspase recruitment domain-containing protein 4,NLRC4)的m RNA表达水平。结果:与对照组比较,H_2O_2处理组的细胞形态明显改变,taxifolin+H_2O_2处理组的细胞形态较H_2O_2处理组明显改善。与对照组比较,H_2O_2处理组的线粒体膜电位明显下降,线粒体ROS合成明显增多(均P<0.05);taxifolin+H_2O_2处理组的线粒体膜电位较H_2O_2处理组升高、线粒体ROS合成较H_2O_2处理组减少(均P<0.05)。同时,与对照组比较,H_2O_2处理组的细胞内caspase-1的蛋白表达以及IL-18,IL-1a,IL-1b,AIM2,ASC,NLRP3和NLRC4的m RNA表达显著上调(均P<0.05),taxifolin+H_2O_2处理组的caspase-1蛋白表达以及IL-18,IL-1a,IL-1b,AIM2,ASC,NLRP3和NLRC4的m RNA表达较H_2O_2处理组显著下调(均P<0.05)。结论:Taxifolin可能通过抑制经典焦亡途径中AIM2,NLRP3和NLRC4炎性小体的生成和激活,从而抑制H9C2细胞氧化损伤后的焦亡发生。

利用果蝇心力衰竭模型筛选果蝇第2号染色体缺失系

果蝇心脏一直以来都是研究心血管发育的极好模型,许多控制心脏分化和特化的调控基因和信号途径从果蝇到哺乳动物都是保守的.由于近年心力衰竭的发病率不断升高,我们最近又建立了果蝇心力衰竭模型用于大规模筛选和鉴定心力衰竭的相关基因.在这个模型中,适龄的成体果蝇被整齐排列在导电的载玻片上,通过电极短暂刺激30s,使果蝇的心跳频率由正常的3Hz增加到6Hz,停止后检测果蝇心率恢复情况,不能恢复正常心跳频率或出现纤维性震颤的果蝇视为心力衰竭.该模型可以在短期内大规模筛选到与心力衰竭相关的基因.利用此心力衰竭模型,我们筛选了164个果蝇2号染色体缺失系,获得33个候选缺失系.这些候选缺失系的心衰率要么与野生型品系相比差异显著,要么与tinman或panier突变系相比差异显著,提示这些缺失系中可能含有与心力衰竭相关的调控基因.