X线诱导大鼠椎间盘髓核细胞体外衰老模型的构建及评价

目的:建立一种由X线诱导的大鼠椎间盘髓核细胞体外衰老模型并对其进行验证评价。方法:选取12只清洁级成熟SD大鼠,取其腰段椎间盘髓核做体外细胞培养,将培养好的髓核细胞按照接受X线照射剂量随机分为0Gy组(对照组)、5Gy组、10Gy组、15Gy组。随后通过细胞形态学观察、β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、细胞增殖检测(cell counting kit-8,CCK-8)、流式细胞术(flow cytometry,FCM)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测、免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测、蛋白印迹实验(Western blot,WB)、1,9-二甲基亚甲基蓝(1,9-dirnethyl-methylene blue,DMMB)比色法检测等实验方法,观察比较不同组别髓核细胞衰老程度和增殖情况,检测衰老相关基因、蛋白和相关因子的表达情况。结果:随着接受X线辐射剂量的增大,髓核细胞在形态学上逐渐表现出典型的衰老特征,并且衰老程度与射线剂量呈正相关,SA-β-Gal测定显示对照组、5Gy组、10Gy组、15Gy组髓核细胞阳性百分比分别是15%、41%、88%和77%。CCK-8实验显示随着辐射剂量的增加,髓核细胞增殖率逐渐降低,第5天10Gy组髓核细胞恢复增殖,而15Gy组髓核细胞仍无增殖表现,FCM证实其细胞仍存在活性,而当辐射剂量提升至20Gy,髓核细胞早期凋亡率骤增。IF及PCR检测均显示衰老基因p16、p21的表达随着髓核细胞接受辐射剂量的增加而逐渐增强,同时聚集蛋白聚糖碎片(aggrecan fragmentation)在WB实验中的表达也逐渐增强。以上实验结果提示15Gy为适宜辐射剂量,再次将15Gy组与对照组比较,CCK-8显示第9天15Gy组髓核细胞依然无增殖表现,PCR检测aggrecan fragmentation的表达15Gy组明显高于对照组(P<0.05)。基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3以及炎症因子IL-6、IL-8在PCR及IF中的表达,15Gy组也明显高于对照组(P<0.05)。结论:X线能诱导体外平面培养的大鼠髓核细胞衰老,接受15Gy辐射量的髓核细胞衰老程度明显且稳定,可作为理想的髓核细胞衰老模型。