海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ在大肠杆菌中的分泌表达及纯化

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是从海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)的毒液中分离得到的一种可以特异性抑制河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的多肽毒素,并且能够选择性抑制Nav1.7亚型电压门控钠离子通道。HNTX-Ⅳ的成熟肽含有35个氨基酸残基,其结构通过3对二硫键稳定。HNTX-Ⅳ是研究钠通道结构和功能以及镇痛药物开发过程中非常有用的一种分子探针,但是其在天然毒素中的含量较少,很难分离足够量的组分进行后续研究。在本研究中,我们通过OEPR克隆构建了HNTX-Ⅳ的大肠杆菌分泌表达质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ。将质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行自动诱导分泌表达,含有6×His标签和SUMO标签的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ成功分泌到大肠杆菌的细胞外培养基中。通过弱阳离子交换柱富集和Ni-NTA柱纯化之后,成功获得了纯度较高的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ。通过Ulp1激酶切割,重组HNTX-Ⅳ(rHNTX-Ⅳ)被释放出来,并通过RP-HPLC分离获得。通过MALDI-TOF质谱鉴定rHNTX-Ⅳ分子量为3.9876kD。通过膜片钳技术,10μmol/L的rHNTX-Ⅳ能够抑制90%以上的hNav1.7的电流,其IC_(50)值为126 nmol/L。本研究成功将HNTX-Ⅳ分泌到了大肠杆菌的细胞外培养液中,并最终获得了纯度较高且具有生理活性的rHNTX-Ⅳ分子,丰富了HNTX-Ⅳ的制备方法,为其后续研究奠定了基础。