改良的石蜡切片技术在基础生物学实验教学中的应用

石蜡切片技术是一项在生物组织学及病理学研究中常用的实验技术。设计'斑马鱼性腺组织石蜡切片'实验,并将改良的技术转化为适合本科基础生物学实验教学的内容。该实验分为组织样本的处理和切片的制备两部分,每部分2~3个学时。通过该实验,学生可以掌握石蜡切片技术的实验原理、实验方法及光学显微镜的使用,并为后续免疫组织化学以及原位杂交等一系列实验的开展奠定了基础。

金鱼JNK1基因的克隆及表达研究

JNKs(c-Jun N-terminal kinases)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的成员,参与应急反应和动物体轴的构建.利用Smart RACE技术首次分离和克隆了金鱼JNK1基因,其cDNA全长2 016 bp,其中阅读框1 115 bp,编码385个氨基酸.对JNK1基因序列进行了同源性分析,结果显示其在脊椎动物较为保守.RT-PCR检测结果显示JNK1基因在金鱼成体组织中的表达存在显著差异,尤其在肝脏中表达量最高,精巢组织中的表达量最低;在不同发育时期的胚胎中,其表达模式为"低-高-低-高-低"的波浪形.研究表明,JNK1基因在鱼类胚胎发育和组织器官形成及发育过程中具有重要作用.

JNK1基因在金鱼性腺不同发育时期的表达分析

为探明JNK1(c-Jun N-terminal kinase 1)在鱼类性腺发育过程中的相关性,以模式动物金鱼为实验对象,采用实时荧光定量PCR(q PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)技术检测JNK1基因及其蛋白在金鱼精巢和卵巢不同发育时期的表达水平。结果表明:金鱼雄鱼和雌鱼的性腺指数(GSI)显示性腺在发育过程中呈明显的季节变化规律,其中在性腺成熟期GSI最高(P<0.05)。q PCR检测结果显示JNK1在卵巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最高(P<0.05),为成熟前期、退化吸收期和修整恢复期表达量的4.0、1.4和2.1倍;JNK1在精巢不同发育时期的表达量总体呈现出微量变化的趋势;在精巢成熟前期表达最低,成熟期、退化吸收期和修整恢复期表达量较成熟期有微量升高,且精巢发育全过程中的表达变化均无显著性差异。Western blotting检测结果显示其蛋白水平表达模式与mRNA的表达水平吻合。研究表明,JNK1在一定程度上与鱼类卵巢发育相关,可能在促进卵细胞的成熟方面具有重要作用。

翘嘴鳜胚胎发育期间酸性和碱性磷酸酶活性的变化

酸性磷酸酶和碱性磷酸酶作为一种磷酸单酯水解酶,在蛋白(酶)的去磷酸化过程中起着非常重要的作用,研究发现磷酸酶是动物发育过程中物质代谢的重要调控酶。采用磷酸苯二钠比色法检测翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)胚胎发育期间酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性变化。结果显示,胚胎受精后进行细胞分裂时的酸性和碱性磷酸酶活性较低,分别为(0.436±0.051)U/g和(0.061±0.009)U/g,发育至囊胚期时酶活性均有微量下降;而从原肠胚时期开始,酸性和碱性磷酸酶的活性随胚胎发育的进行呈现上升趋势,在出膜时期达到最高,分别为(1.076±0.063)U/g和(0.335±0.021)U/g,酶活性显著增强(P<0.05)。这一结果表明,翘嘴鳜胚胎在原肠胚期合成了磷酸酶,且磷酸酶在胚胎发育期间的细胞增殖、信号传导和物质代谢等方面可能发挥重要作用。

TP53INP2/DOR在转录调控、细胞自噬和相关疾病中的作用

肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白2(TP53INP2),也称糖尿病与肥胖调控蛋白(DOR),在骨骼肌、心肌和脑等代谢旺盛的组织中表达水平较高。TP53INP2在细胞核内主要发挥转录辅激活因子的作用,如作为甲状腺激素受体的辅激活因子调控甲状腺激素相关基因的表达。后续研究发现,TP53INP2为细胞内重要的分解代谢途径—细胞自噬所必需,饥饿时TP53INP2出核参与自噬的起始。在骨骼肌中,TP53INP2通过促进自噬导致肌肉流失,而在白色脂肪组织中,TP53INP2则通过促进自噬抑制脂肪前体细胞的分化。此外,在营养丰富的条件下,TP53INP2能够定位于核仁,协助r DNA转录起始前复合物的组装,促进r DNA的转录,参与细胞内重要的合成代谢—核糖体的生物发生。临床统计数据表明,TP53INP2的表达水平与糖尿病和某些类型的癌症早期的发生发展密切相关。本文对TP53INP2在转录调控、细胞自噬和相关疾病如癌症与糖尿病中的生物学功能进行综述。

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P<0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P<0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。

溶酶体的生物学功能与相关疾病研究进展

近年来的研究发现,溶酶体不只是细胞内代谢废物的回收站,在细胞内的物质运输、细胞膜修复、糖脂代谢等过程中均发挥重要作用。溶酶体在营养物质相关的信号转导过程中也充当关键的调控点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)作为细胞内重要的代谢调节蛋白,均可以在溶酶体膜处激活。此外,溶酶体作为自噬途径的降解中心,通过与自噬体融合获取并降解自噬底物,在蛋白和细胞器的质量控制方面发挥重要作用。MiT/TFE(microphthalmia/transcription factor E)蛋白家族通过促进几乎一整套溶酶体基因的表达,从而促进溶酶体的生物发生。溶酶体活性的异常与代谢紊乱、神经退行性疾病和肿瘤等疾病的发生发展密切相关。该文将对溶酶体的生物学功能以及其功能异常引起的相关疾病进行综述。

miRNAs对动物肠道健康的调控作用

miRNAs(micro RNAs)是一类长约22 nt,参与mRNA转录后调控的非编码小分子RNA。作为基因表达的关键调控因子,其参与了各类细胞的增殖、分化、凋亡以及机体的生长发育等多种生命活动。肠道不仅是机体营养物质消化吸收的主要部位,也是重要的免疫器官。研究表明,miRNAs在肠道中的表达丰富,对肠道正常的发育及功能起重要的调控作用。文章结合本研究组的研究成果,对miRNAs的生物合成以及其对动物肠道功能的影响、肠道稳态的维持等方面的研究进展做简要综述,以期在分子营养学方面,为深入了解miRNAs对动物肠道健康的调控作用提供理论指导依据。

JNK抑制剂SP600125对金鱼胚胎发育及JNK1表达的影响

为探明JNK信号通路在鱼类胚胎发育过程中的作用,通过使用JNK信号特异性抑制剂SP600125对金鱼胚胎进行浸泡处理,采用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测JNK1 mRNA和蛋白在胚胎不同发育时期的表达。结果显示:从受精卵发育至原肠胚期后,SP600125能够显著阻滞胚胎的发育时间,同时伴随大脑、眼睛、心脏和体节等组织器官的发育迟缓并出现畸形。q PCR检测结果显示JNK1在实验组和对照组中的表达模式没有明显变化,均表现为"升高-降低-升高-降低"的趋势。Western Blotting检测结果显示JNK1蛋白的表达在对照组中的表达模式与mRNA的表达水平吻合,而实验组中,胚胎发育至原肠胚后JNK1蛋白持续保持较低水平的增加。研究表明,JNK信号通路在鱼类胚胎发育和组织器官发生及发育过程中发挥了重要作用。

亚精胺抑制核糖体DNA转录

核糖体是细胞内合成蛋白的唯一细胞器,主要由核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)和核糖体蛋白组装形成.rDNA转录生成rRNA在细胞内的核仁处完成,是核糖体生物发生的重要限速步骤之一.在正常细胞内,核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)的转录活性受到营养状态的严密调控.而在癌细胞内,癌基因的激活、抑癌基因的失活和生长相关信号通路的失调等多种不同的机制均可导致rDNA的转录绕过营养状态的控制.癌细胞内异常激活的rDNA转录是癌细胞快速生长、增殖的必要前提,也是癌细胞的共有特征之一.抑制癌细胞内异常激活的r DNA转录有望开发出新的抗癌药物.我们既往的研究揭示,肿瘤蛋白p53诱导核蛋白2(tumor protein p53 inducible nuclear protein 2,TP53INP2)的核仁定位是其促进rDNA转录的重要前提,可用来指示细胞内的rDNA转录活性.本研究发现,天然活性成分亚精胺可抑制TP53INP2的核仁定位,并显著降低细胞的rDNA转录活性.机制研究表明,亚精胺可抑制蛋白激酶雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)的必需亚基Raptor的乙酰化并降低细胞内m TORC1的活性,进而抑制r DNA的转录.功能研究揭示,亚精胺可显著抑制蛋白的合成和细胞的增殖.本研究提示,抑制细胞内的r DNA转录活性可能是亚精胺发挥抗癌作用的重要机制之一.

LC3脂质化修饰的机制和功能研究进展

LC3(包括LC3/GABARAP蛋白家族所有成员)的脂质化修饰是细胞自噬过程中的关键事件.LC3完成脂质化修饰后,由水溶性形式转化为膜结合形式,在自噬小体的形成、自噬底物的招募和自噬小体-溶酶体融合等阶段均发挥重要作用.包括营养状态和病原菌入侵在内的多种细胞内外刺激信号均可参与调控LC3的脂质化修饰过程.近年来的研究发现,脂质化的LC3不仅可以靶向细胞内双层膜的自噬小体,也可以靶向细胞内多种单层膜结构,如吞噬体和溶酶体等,参与调控细胞的内吞和微自噬等生物学过程.本文将围绕LC3脂质化修饰的机制和功能综述近年来的相关研究进展.

WIPI2在经典自噬和非经典自噬中的作用

细胞自噬是真核生物特有的依赖溶酶体的细胞内降解途径,通过清除蛋白聚集体、受损细胞器和入侵病原体等细胞内容物,维持细胞内环境稳定.WIPI蛋白是在哺乳动物细胞中鉴定的与细胞自噬密切相关的一类蛋白家族.其中,WIPI2主要调控自噬前体的延伸过程,是直接参与自噬小体形成的少数必需蛋白之一.WIPI2可通过多种不同的作用方式行使功能.近年来的研究发现,除了营养剥夺诱导的经典自噬,WIPI2对于病毒感染诱导的非经典自噬同样必不可少.而且,在不同类型的自噬途径中,不同的细胞内外刺激信号可通过调控WIPI2的蛋白稳定性或者WIPI2与自噬前体的亲和力,影响细胞内的自噬水平,帮助细胞更好地应对内外环境的改变.值得一提的是,WIPI2的功能缺失突变与一类引起发育障碍的人类遗传病相关.本文主要围绕WIPI2在经典自噬和非经典自噬中的作用方式与调控机制,综述近年来的研究进展.

肠道隐窝-绒毛轴上皮细胞更新及调控机制研究进展

肠道不仅是营养物质消化吸收的主要部位,也是重要的免疫器官和内分泌器官.小肠上皮细胞的分化对于肠道应激后的损伤修复、免疫屏障以及肠道功能的正常行使具有非常重要的意义.近年来,肠道上皮隐窝-绒毛轴干细胞自我更新、分化和调控的研究得到了快速发展.本文结合本研究组的研究成果综述了哺乳动物肠道隐窝-绒毛轴上皮细胞分化过程中差异基因和蛋白表达;信号通路、转录因子和表观遗传修饰对肠上皮细胞分化的影响以及营养因子对肠道细胞分化和损伤修复调控的最新研究进展,以期在营养学和药理学方面,为干预和治疗肠道损伤及相关疾病提供理论指导依据.

内质网应激与细胞自噬的关系

内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是真核细胞普遍存在的应激–防御机制。ERS状态下,细胞会启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)增强对未折叠蛋白的折叠和对错误折叠蛋白的降解,以恢复内质网的正常生理功能。一些引发ERS的刺激也会诱发细胞自噬。自噬作为真核细胞保守的降解机制,可通过加快错误折叠蛋白的降解,降低ERS水平,是继UPR之外帮助内质网恢复稳态的另一重要角色。研究表明,ERS及其伴随的细胞自噬与很多疾病的发生发展密切相关。然而,ERS如何引发细胞自噬,自噬如何反馈调节ERS,UPR与细胞自噬如何关联,这些问题并未得到详细的探讨和阐释。因此,该文对ERS和细胞自噬的关系及其关联机制进行综述,以期为相关疾病发病机制的阐明和开发新的治疗策略提供依据。

mTORC1信号通路调控细胞自噬的研究进展

蛋白激酶mTORC1主要感应细胞内的营养状态和细胞外的压力刺激,通过磷酸化众多下游底物蛋白,参与调控细胞的生长、增殖和代谢等过程.近年来的研究表明,m TORC1信号通路在细胞内的重要分解代谢过程--细胞自噬的调控中发挥主导作用.在细胞自噬过程的不同阶段发挥作用的多个蛋白陆续被鉴定为mTORC1的直接磷酸化底物,表明mTORC1在细胞自噬过程的不同阶段均发挥调控作用.以上作用机制让mTORC1精确而全面地控制细胞自噬的起始、终止和强度,进而帮助细胞更好地应对细胞内外环境的改变.本文将围绕mTORC1信号通路在细胞自噬调控中的主导作用综述近年来的相关研究进展.