基因芯片对外阴尖锐湿疣患者宫颈脱落细胞中HPV亚型的检测

目的探讨外阴尖锐湿疣(CA)患者宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染亚型状况,为临床尖锐湿疣诊断及宫颈癌的防治提供实验依据。方法采用基因芯片方法检测77例CA患者和同期无外阴CA的64例对照宫颈脱落细胞中HPV-DNA亚型(包括5种低危型和18种高危型)。结果77例CA患者标本中检出HPV阳性64例,阳性检出率为84.4%,高于对照组的18.75%(P<0.01),共检测出12种HPV基因型别,其中低危型(HPV6、11、43、44)感染21例,占32.8%;高危型(HPV161、8、31、334、5、565、8、73)感染30例,占46.9%;高低危同时感染13例,占20.3%。结论基因芯片是一种敏感性高,特异性好,适合临床HPV分型检测的方法。外阴CA患者宫颈HPV感染较为普遍,且高危型感染占有相当大的比例,因此对外阴CA患者在治疗疣体同时需进行HPV-DNA检测,必要时需进行相应治疗,以期较低宫颈癌的发病风险。

IGF-ⅠR抑制剂联合西妥昔单抗对人肝癌细胞的体外抑制作用

目的探讨西妥昔单抗与胰岛素样生长因子-Ⅰ受体（IGF-ⅠR）抑制剂aIR3对人肝癌细胞株HepG2细胞的作用。方法选用浓度递增的西妥昔单抗（5-500）mg／mL和aIR3（2．5～250．0）μmol／L，单独或联合作用于HepG2细胞，观察不同时间对细胞增殖的抑制作用以及联用时的两药协同系数。结果单药西妥昔单抗与aIR3对HepG2细胞增殖的抑制作用均呈浓度依赖性与时间依赖性，二药单独作用于HepG2细胞72h最大抑制率分别为42．2％、82．3％，二药联合作用于HepG2细胞72h最大抑制率达91．8％。西妥昔单抗与aIR3不同浓度在各时间点的协同系数均小于1。结论西妥昔单抗和aIR3在体外对HepG2细胞的增殖均具有一定的抑制作用，联合应用时具有明显的协同效应。

白细胞介素-8、C反应蛋白及降钙素原与创伤性多器官功能障碍综合征发生及预后的相关性

目的：探讨白细胞介素-8（IL-8）、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）对创伤性多器官功能障碍综合征（MODS）发生过程及预后的影响。方法：收集2012年1月~2013年1月在湖州市中心医院重症医学科住院的严重创伤最终发展为MODS的患者40例作为MODS组,将门诊健康检查体检者30例作为对照组,同时将MODS组根据转归分为死亡组与非死亡组,分别检测患者入院24 h内外周血IL-8、CRP、PCT的浓度。结果：MODS组IL-8水平明显高于对照组,死亡组IL-8水平明显高于非死亡组,且差异均有统计学意义（P〈0.05）;MODS组CRP水平明显高于对照组,死亡组CRP水平明显高于非死亡组,且差异均有统计学意义（P〈0.05）;MODS组PCT水平明显高于对照组,死亡组PCT水平明显高于非死亡组,且差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：IL-8、CRP、PCT水平在创伤性MODS患者升高,揭示其可能参与了MODS的发生。创伤后致炎因子血浆水平的测定可以作为一种有价值的免疫学监测,有助于MODS患者预后评估。

IGF-ⅠR信号通路在西妥昔单抗抗HepG2细胞增殖中的作用

目的探讨IGF-ⅠR信号通路在西妥昔单抗抗HepG2细胞增殖中的作用。方法选用浓度递增的西妥昔单抗(5～500)mg/mL、胰岛素样生长因子(IGF)(2.5～250)μmol/L及其抑制剂aIR3(2.5～250)μmol/L,单独或联合作用于HepG2细胞,观察IGF与aIR3对西妥昔单抗抗HepG2增殖的影响。结果细胞培养72 h后,单药西妥昔单抗对HepG2细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性,西妥昔单抗联合aIR3组增殖抑制率在相应浓度下均显著高于同浓度的西妥昔单抗组(均为P<0.01),IGF(10～250)μmol/L与西妥昔单抗(20～500)mg/mL联合组增殖抑制率均显著低于相应浓度的西妥昔单抗组(均为P<0.01)。结论 IGF-ⅠR通路可影响西妥昔单抗抗HepG2细胞增殖的作用,可能是肝癌细胞株对西妥昔单抗耐药的机制之一。

中期因子在不同分子分型的乳腺癌中的表达及其临床意义

探讨在5种不同分子分型的乳腺癌中中期因子在组织中的表达,并分析其临床意义。采用免疫组化法检测203例乳腺癌组织的中期因子表达量;采用CD105抗体标记微血管内皮细胞,计算微血管密度(MVD)。结果显示,中期因子与肿瘤的淋巴结转移、临床分期相关性密切。中期因子表达量高的样本具有较高的以CD105表征的微血管密度。与其他4种分子分型相比,中期因子和CD105在基底细胞样型的表达量最高,但是该差异不具有统计学意义。中期因子可以作为乳腺癌预后的标记物应用于临床诊断和治疗,与其他分子亚型的乳腺癌相比,基底细胞样型的乳腺癌可能并不具有独特的血管生成模式。

CEA、CAl25、CYFRA21-1和NSE在肺癌中的诊断价值

目的探讨综合运用Logistic回归和受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析四项肿瘤标志物对肺癌的诊断价值。方法采用放射免疫法检测112例原发性肺癌和74例肺良性疾病患者血清中癌胚抗原（CEA）、糖类抗原-125（CAl25）、细胞角蛋白片段19（CYFRA21-1）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达水平。通过Logistic回归建立回归模型，用ROC曲线分析4项肿瘤标志物在肺癌诊断中的意义。结果肺癌患者血清中CEA、CAl25、CYFRA21．1和NSE的表达水平[4．53（2．22—11．53）ng／ml、28．97（11．39—62．10）u／ml、4．05（2．29—8．18）ng／ml、14．11（11．35—24．12）ng／m1]明显高于肺良性疾病患者[2．08（1．45—2．52）ng／ml、12．90（9．80-19．44）U／ml、1．53（1．21—2．17）ng／ml、11．38（9．07—12．80）ng／m1]，差异有统计学意义（均P〈0．01）。通过Logistic回归建立回归方程Y=1／[1＋EXP（4．902—0．394X]-0．627X2—0．165X3）]，经ROC曲线分析，新变量Y的ROC曲线下面积（AUC）为0．915＋O．020，敏感度79．46％、特异度93．24％、准确度84．95％。结论运用Logistic回归和ROC曲线综合分析可提高肺癌的诊断。

中期因子mRNA在非小细胞肺癌患者外周血中的表达及其临床意义

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血中中期因子（MK）mRNA的表达及其临床意义。方法采用定量聚合酶链反应（PCR）法检测87例NSCLC患者、35例肺良性疾病患者及30例健康志愿者外周血中MKmRNA的表达。结果NSCLC患者外周血中MKmRNA的相对表达（6．749±1．117）与良性疾病患者（7．988±0．633）和健康志愿者（8．156±0．525）比较，差异有统计学意义（P〈0．05），而后两者比较差异无统计学意义（P〉0．05）。NSCLC患者外周血中MKmRNA表达水平与其临床TNM分期，细胞分化程度及淋巴结转移密切相关（P〈0．05），而与年龄、性别、吸烟与否和病理类型无明显相关（P〉0．05）。结论外周血MKmRNA有望成为NSCLC微转移检测的有效标志物。

黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液对HL-7702和HepG2细胞毒性研究

目的研究黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液对HL-7702和HepG2细胞的毒性。方法 75%乙醇回流提取得黄药子提取物,高、中、低剂量作用于Caco-2细胞,以黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用于HL-7702和HepG2细胞,进行细胞活性实验,测定生化指标ALT、AST、GSH-PX和MDA值。结果与对照组比,高剂量组和中剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用后,HL-7702和HepG2细胞的存活率显著降低(P<0.01);高剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用72 h后,HL-7702细胞上清液中ALT、AST显著升高(P<0.01);高剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用48 h和72 h后,HepG2细胞上清液中ALT、AST显著升高(P<0.01)。高剂量组和中剂量组黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液作用48 h和72 h后,HL-7702和HepG2细胞上清液中MDA显著升高,GSH-PX显著降低(P<0.01)。结论黄药子醇提物Caco-2细胞摄取液对HL-7702和HepG2细胞有毒性。

多重荧光定量聚合酶链反应对呼吸道感染患儿支原体和衣原体感染的诊断价值

目的探讨多重荧光定量PCR技术（TaqMan探针法）在检测呼吸道感染住院患儿中肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）和沙眼衣原体（CT）的应用价值。方法构建质粒标准品，梯度稀释后进行扩增建立标准曲线检测多重荧光定量PCR方法的扩增效率，并验证其敏感性、特异性和重复性；收集151例疑似呼吸道感染住院患儿的咽拭子样本，采用多重荧光定量PCR技术检测MP、CP和CT基因片段，其中128例样本同时进行MP—IgM和CP—IgM的血清学检测，评价该方法在临床检测中的应用价值。结果本实验中MP、CP和CT三种病原体的引物和探针的扩增效率分别达到109．20％、116．90％和112．80％，三种病原体的最低检出浓度分别为50、25和25pg／μL，与其他已知病原体不存在交叉反应；不同批次间三种病原体的扩增Ct值的变异系数均小于3％。151份样本中，多重PCR检测出MP、CP和CT阳性率分别为23．84％（36份）、17．88％（27份）和2．65％（4份），128份样本中MP—IgM阳性检出率为22．65％；CP—IgM阳性检出率为14．06％。结论多重荧光定量PCR方法可以为临床幼儿呼吸道感染病原体的早期检测提供快速可靠的辅助诊断依据。

人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高灵敏度和高特异性的人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白抗体并对其效价进行初步评估。方法构建含有H5N1亚型禽流感病毒NS1序列的pET一28a（＋）重组载体的大肠埃希菌BL21（DE3），诱导表达NS1蛋白，并经Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得NS1重组蛋白，并进行SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。以纯化的蛋白为抗原免疫新西兰大白兔，获得兔抗NS1血清，亲和纯化获得多克隆抗体。应用ELISA和WesternBlot检测纯化抗体的效价和特异性。结果NS1融合蛋白得到高表达，且纯度〉90％，用该融合蛋白免疫新西兰大白兔后得到的抗NS1多克隆抗体，效价达1：80000，并特异性识别H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白。结论获得了NS1多克隆抗体，具有较好的效价和特异性。

应用液相色谱-飞行时间质谱技术对肺癌患者血清代谢组学的研究

目的应用代谢组学技术分析肺癌患者和正常人群血清的代谢物质。方法运用高效液相-四级杆-飞行时间质谱（LC—Q—TOF／MS）联用技术对30例肺癌患者与30名正常人血清进行研究。采用正交最小二乘分析法（OPLS）进行建模，运用两样本t检验寻求两组间差异性代谢物。结果多变量统计结果显示肺癌患者和正常对照人群的代谢谱有明显差异，根据t检验结果寻找到血清中相关的差异代谢物36种。结论建立了利用LC—Q—TOF／MS技术进行肺癌血清代谢组学研究的方法。

微小RNA-10b在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨胃癌组织和癌旁组织中微小RNA（miR）-10b的表达差异及其临床意义.方法 采用SYBR Green Ⅰ荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法检测78例胃癌患者手术切除癌组织及配对癌旁组织标本中miR-10b的表达水平.结果 miR-10b在胃癌组织中的相对表达水平（6.758±2.301）显著高于其在配对癌旁组织中的表达（8.516±1.870）,差异有统计学意义（P＜0.01）.胃癌组织中miR-10b的表达水平与临床TNM分期（P＜0.01）、肿瘤大小（P＜0.01）、淋巴结转移（P＜0.01）以及肿瘤浸润深度（P＜0.01）密切相关,而与年龄、性别、分化程度无明显相关（P＞0.05）.结论 胃癌组织中miR-10b的高表达可能与胃癌的发生、发展、侵袭、转移相关.

靶向中期因子反义寡核苷酸的体内抗肿瘤效应

目的观察靶向中期因子反义寡核苷酸的体内抗肿瘤效应。方法构建人肝癌裸鼠原位移植瘤模型48只，随机分6组，生理盐水对照组，MK—AS（每日25、50、100mg／kg）组，MK-Sen（每日50mg／kg）组和5-Fu（每日10mg／kg）组，放免法检测血清AFP浓度，Westernblot检测组织MK、p53、bax、bcl-2和Caspase-3蛋白水平。结果（1）与生理盐水对照组比较，MK—AS治疗组的肿瘤体积明显减小，[（807．75±195．19）mm^3比（552．75±84．38）、（532．00±121．57）、（294．50±70．66）mm^3]，差异有统计学意义（P〈0．01）；（2）MK—AS治疗组的肿瘤瘤重与生理盐水对照组比较显著降低，[（1．29±0．13）g比（0．70±0．14）、（0．64±0．18）和（0．44±0．18）g]，差异有统计学意义（P〈0．01）；（3）MK—AS明显下调肿瘤组织MK和bcl-2蛋白的表达，而p53、bax、Caspase-3表达上调。结论MK—AS具有明显的体内抗肿瘤效应；MK-AS的抗肿瘤效应可能与凋亡相关蛋白p53、bax、Caspase-3表达水平的上调和bcl-2的下调有关。

微小RNA-1260b在非小细胞肺癌组织的表达及临床意义

目的 检测非小细胞肺癌（NSCLC）及癌旁组织中微小RNA（miRNA,miR）-1260b的表达,探讨miR-1260b在肺癌发生发展中的临床意义.方法 收集非小细胞肺癌组织和癌旁组织,通过miRNA芯片筛选出癌组织和癌旁组织之间的差异表达的miRNA,采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）进行扩大样本检测,验证差异miRNA在肺癌组织和癌旁组织的表达.结果 通过miRNA芯片实验筛选出差异表达的miRNA经扩大样本验证,采用循环阈值（ΔCt）对miR-1260b在肺癌和配对癌旁组织中的表达水平进行定量分析,ΔCt值分别为10.04±1.43和10.97±1.17;与对应的癌旁组织比较,82.2％的病例中miR-1260b表达升高（2-ΔΔCt值＞1）,只有18.8％的病例显示miR-1260b在肺癌组织的表达下降（2-ΔΔCt值＜1）,差异有统计学意义（P＜0.05）.此外,肺癌组织中miR-1260b的表达水平与患者年龄,性别、肿瘤分化程度和临床分期无明显正相关.结论 miR-1260b在非小细胞肺癌组织的表达水平高于对应的癌旁组织,可能与非小细胞肺癌的发生发展相关.

利用寡核苷酸芯片鉴定多种肠道致病菌方法的建立与初步应用

目前，临床上对腹泻样本的检测主要依靠传统的细菌学培养及生化鉴定，操作方法繁琐，检测周期较长，而利用分子生物学方法如PCR、探针杂交等及免疫学方法也存在特异性差和灵敏度低等问题。自寡核苷酸芯片技术建立以来，以其特异性高、操作简单、高通量、快速等特点，已广泛应用于生物学的各个研究领域。目前，寡核苷酸芯片应用于病原菌检测的研究较多，但同时检测的病原菌数量较少。本实验采用通用引物PCR结合寡核苷酸芯片对10种临床检测的肠道致病菌进行鉴定。

中期因子在乳腺癌患者血清中的表达及其临床意义

目的 检测乳腺癌患者血清中期因子（MK）水平,并探讨其临床意义.方法 采用酶联免疫吸附试验（EUSA）检测120例乳腺癌患者手术前后,50例乳腺良性肿瘤患者及100例正常人血清MK水平,比较它们之间的不同及乳腺癌患者术前血清MK水平与临床病理指标之间的关系.结果 血清MK水平在乳腺癌组的阳性率为65.52％,明显高于乳腺良性肿瘤组（6.00％）和正常对照组（4.00％,P＜0.01）；乳腺癌术前组血清MK水平[1 372（896,3 246） ng/L]明显高于乳腺癌术后组[784（563,890） ng/L]、乳腺良性肿瘤组[465 （420,574） ng/L]或正常对照组的血清MK水平[450（400,554） ng/L],差异有统计学意义（P＜0.01）；术后肿瘤复发组血清MK水平[2358（1 123,4 787） ng/L]亦明显高于乳腺癌术前组血清MK水平,差异有统计学意义（P＜0.01）,而乳腺良性肿瘤组与正常对照组的血清MK水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）；乳腺癌术前组血清MK水平与肿瘤的大小、临床TNM分期、组织学分级和是否伴有腋淋巴结转移有关（P＜0.01）,而与年龄、月经状况、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）无明显相关（P＞0.05）.结论 乳腺癌患者血清MK水平与手术与否、临床TNM分期、肿块大小、腋淋巴结转移状况及复发有关,可用于乳腺癌患者的辅助诊断、疗效观察和复发监测.

磷脂混杂酶1在肝癌中的表达及其临床意义

目的 观察磷脂混杂酶1（PLSCR1）对肝癌生长转移的调控作用。方法 构建PLSCR1干扰细胞株,通过噻唑蓝（MTT）实验和侵袭（Invasion）实验分别研究PLSCR1在肝癌细胞HepG2的增殖和侵袭中的作用。通过荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测20例肝癌患者的癌组织及癌旁组织中PLSCR1的表达,探讨PLSCR1在肝癌生长及转移中的意义。结果 成功构建PLSCR1-小干扰RNA（siRNA）-HepG2细胞株,并通过MTT实验和Invasion实验证实干扰PLSCR1对肝癌细胞的生长及侵袭具有抑制作用,其抑制率分别为（28.71±1.27）%和（27.16±10.40）%。FQ-PCR检测20例肝癌患者的癌组织及癌旁组织中PLSCR1的表达,发现PLSCR1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织（ΔΔCt：-2.57±1.34）,并与肿瘤分化程度和临床分期等病理因素明显相关（P〈0.05）。结论 PLSCR1在肝癌组织中高表达,并与肝癌的发生、发展密切相关。

清肺排毒汤对大鼠整体代谢及肠道菌群的调节作用研究

通过代谢组学和肠道微生物组学探讨清肺排毒汤(Qingfei Paidu Decoction,QPD)对大鼠整体代谢及肠道菌群的影响,为揭示清肺排毒汤的临床药效机制提供实验依据。采用GC-MS结合LC-MS/MS的非靶向代谢组学以及肠道微生物组学方法,对清肺排毒汤干预大鼠5 d后的血清内源性代谢物谱与肠道菌群组成开展了系统的研究。基于GC-MS和LC-MS/MS代谢组学方法分别获得清肺排毒汤调控的23种和43种差异代谢物,涉及的代谢通路主要包括甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、TCA循环和丙酮酸代谢。利用基于16S rDNA测序分析发现清肺排毒汤显著调节了大鼠肠道菌群的组成,明显上调Romboutsia,Turicibacter,Clostridiumsensustricto1的相对丰度,下调norankfLachnospiraceae的相对丰度。该研究证明清肺排毒汤短期干预能够显著调节大鼠整体代谢,并调节动物的肠道菌群组成,提示清肺排毒汤的临床疗效可能与其对机体的内源性代谢调控及肠道菌群组成的调节有关。

碱性成纤维生长因子、表皮生长因子和血小板衍生因子对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板衍生因子（PDGF－BB）对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖和成骨分化的影响。方法采用贴壁培养纯化小鼠BMSCs，培养液（DMEM／F12，10％胎牛血清，青、链霉素）中添加（实验组）或者不添加（对照组）细胞因子bFGF、EGF和PDGF－BB（浓度均为10μg/L）进行培养，取传至第3代的细胞进行成骨分化，成骨诱导液：1×10-8mol／L地塞米松、50μmol／L抗坏血酸、10mmol／Lβ-甘油磷酸钠。流式细胞仪检测细胞表面标记抗原CIM5和CD90的表达；SYBgreen荧光定量聚合酶链反应（PCR）扩增检测成骨细胞特异性基因骨钙素和I型胶原的表达；碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测成骨细胞的分化。结果初始接种后，对照组的小鼠BMSCs贴壁较快，而传代后实验组的小鼠BMSCs增殖较快。对照组和实验组的小鼠BMSCs经传代纯化后CIM5、CD90的阳性表达率分别为（27．344-0．69）％、（41．93±0．34）％和（0．48±0．12）％、（82．78±0．25）％，实验组的小鼠BMSCs在传代过程中较少观察到细胞的老化现象，细胞的纯化程度较高，而且其向成骨分化的效率明显高于对照组细胞。结论联合使用细胞因子bFGF、EGF和PDGF－BB可促进小鼠间BMSCs的体外增殖和干性的维持，并且有利于其向成骨细胞的分化。

从噬菌体肽库中筛选并鉴定中期因子特异性结合肽

目的筛选并鉴定可与中期因子（MK）特异性结合的短肽。方法以人重组MK蛋白为靶分子，分别从噬菌体随机7肽和环7肽展示库中筛选出与MK蛋白高特异性结合的阳性噬菌体克隆。酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定所挑选噬菌体和MK蛋白的亲和力。噻唑蓝（MTT）比色法体外评价该合成短肽对HepG2细胞生长的抑制作用。结果经过3轮淘洗，筛选出的20个阳性克隆与MK蛋白均具有一定结合力，测序并推导出优选的3条线性肽和3条环肽的氨基酸序列，合成肽能不同程度抑制HepG2细胞的增殖，其中MK-P3（CTSTAMDNC）抑制HepG2增殖作用最强（P〈0．01），其对HepG2肝癌细胞的抑制率可达40．7％。结论成功筛选出了4条可和MK蛋白结合并对肿瘤细胞有一定抑制作用的短肽。