人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用。本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定。方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a(+)中。进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性。结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a(+)载体中,经酶切与测序鉴定完全正确。此重组质粒转化入大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr70000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%。经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%。结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达;蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡。

HCPT诱导肝癌细胞凋亡时AIF定位变化与DNA的损伤

目的:探讨羟基喜树碱(HCPT)诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中凋亡诱导因子(AIF)不同时相的定位变化和DNA损伤的关系。方法:HCPT作用SMMC-7721细胞后在不同时间点收集细胞,用细胞组分分离试剂盒分离细胞质、线粒体与细胞核成分,用蛋白印迹法与共聚焦显微镜观察AIF的转位,用TUNEL法检测DNA损伤。结果:蛋白印迹结果显示线粒体中AIF在HCPT作用1h无明显变化,6h出现了明显转位,在12h与24h更明显;共聚焦结果也显示在HCPT作用6h后,AIF已从线粒体迁出,12h与24h后,大部分AIF已从线粒体迁至细胞核;TUNEL法检测结果表明伴随AIF的核迁移,DNA出现了明显的损伤。结论:HCPT作用SMMC-7721细胞后AIF的释放是凋亡的早期改变之一;伴随AIF的核转位,同时出现了DNA损伤。

羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞线粒体跨膜电位耗散的蛋白质组分析

目的比较蛋白质组,分析羟基喜树碱诱导肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡前后的线粒体蛋白质表达谱。方法用羟基喜树碱诱导肝癌SMMC-7721细胞发生线粒体跨膜电位耗散,提取线粒体并用Western blot法对线粒体纯度进行鉴定；用二维凝胶电泳分离溶解度不同的3种蛋白质组分并对蛋白质进行银染色；利用PDQuest图像分析软件分析比较凝胶结果,获得差异蛋白质；采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定部分差异蛋白质,并用Western blot法对部分差异蛋白质进行进一步的鉴定。结果羟基喜树碱成功地诱导线粒体发生跨膜电位耗散,并获得纯度很高的线粒体；通过PDQuest图像分析软件发现,线粒体发生跨膜电位耗散前后比较约有39个蛋白质点表达有差异,对其中28个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析,鉴定出20种可能的蛋白质。结论获得了羟基喜树碱诱导线粒体凋亡前后差异蛋白的相关信息,为从蛋白质水平进一步研究羟基喜树碱诱导癌细胞发生凋亡的机制奠定了基础。