mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白。方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体。脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定。3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用。结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖。结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础。

内皮抑素在兔VX2肝移植瘤介入治疗中的应用价值

目的探讨内皮抑素在兔VX2肝移植瘤介入治疗中的应用价值。方法建立兔肝移植瘤模型,随机分为对照组(NS,10只),TACE组(Lipiodol+ADM,10只)和内皮抑素组(Lipiodol+ADM+ES,10只),多排螺旋CT测量肿瘤大小,计算肿瘤增长率(GR);术后1周取出病理标本,利用免疫组化染色及半定量RT-PCR法分别检测残瘤组织微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)表达。结果3组肿瘤增长率分别为对照组(270.86±148.94)%,TACE组(-8.91±21.77)%,内皮抑素组(-20.40±36.07)%,3组间相互比较,对照组呈明显正增长,与其余2组比较差异均有统计学意义(P<0.01),而TACE组与内皮抑素组之间差异无统计学意义(P>0.05);各组的MVD值分别为80.00±17.14(对照组)、84.22±16.45(TACE组)和57.00±13.26(内皮抑素组),内皮抑素组MVD值最低,与另外2组比较差异均有统计学意义(P<0.05),对照组和TACE组之间差异性不明显(P>0.05);VEGF165mRNA:对照组为(0.85±0.056),TACE组为(1.10±0.087),内皮抑素组为(0.72±0.065),TACE组表达水平最高,与其余2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论兔VX2肝移植瘤的介入治疗中应用内皮抑素后,肿瘤明显缩小,肿瘤组织VEGF的表达减低,MVD的分布减少,提高了肿瘤的治疗效果。

小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的:重组表达小鼠IL-1β全长基因,转染H22肝癌细胞,分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法:构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,利用jetPEI转染H22肝癌细胞,RT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达,MTT方法分析转染前后,野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化。结果:RT-PCR扩增出小鼠IL-1β,长度约843bp。纯化的PCR产物与pIRES2-EG-FP同时经XhoI和EcoRI双酶切,在T4连接酶作用下连接,转化大肠杆菌,提取质粒经PCR、限制性酶谱分析(XhoI+EcoRI)和DNA序列测定后,确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中,RT-PCR和荧光观察证实,H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体,与转染空载体的对照组细胞相比,IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强,同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降,效靶比40:1时下降了约10%。结论:IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制。

小鼠OX40稳定表达细胞株的构建及其对B细胞促分化作用的研究

目的:构建稳定表达小鼠OX40的细胞株HUVEC,并探讨其对B细胞的促增殖作用。方法:从ConA活化的小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增小鼠OX40的cDNA,并将其克隆到pUCm-T载体中,经PCR、酶切和测序分析,进而构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体。以脂质体法转染HUVEC,经G418筛选后,用流式细胞术检测OX40分子的表达。采用3H-TdR掺入法,研究OX40信号对体外培养的B细胞的促分化作用。结果:构建了OX40基因的真核表达载体。经PCR、酶切和测序证实,插入的目的片段与GenBank登录的小鼠OX40cDNA序列完全一致。用G418筛选后,获得能稳定表达小鼠OX40蛋白的HUVEC细胞。3H-TdR掺入法结果显示,小鼠OX40稳定表达的细胞HUVEC对体外培养的B细胞具有促增殖、分化的作用。OX40/OX40L信号与CD40/CD40L信号具有协同作用。结论:成功地构建小鼠OX40稳定表达地细胞,OX40对B细胞具有促增殖、分化作用。

人IL-1β重组表达载体在肝癌细胞的表达及对其NK细胞杀伤敏感性的影响

目的:构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法:RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,RT-PCR分析IL-1β的表达水平,MTT方法分析转染前后NK细胞对肝癌细胞杀伤活性的变化。结果:从LPS处理的人外周PBMCs总RNA中扩增出IL-1β(大小约829 bp),先构建pMD18-IL-1β克隆载体,DNA序列鉴定正确后,利用Pfu DNA聚合酶将IL-1β基因亚克隆到pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1β,经PCR、限制性酶谱分析(BamHⅠ和EcoRⅠ)和DNA序列测定正确后,将其转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达IL-1β的细胞,与转染空载体的细胞相比,该细胞对NK-92细胞杀伤的敏感性显著降低,效靶比10∶1时下降了约30%。结论:促炎性细胞因子IL-1β能够显著增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是导致肝癌细胞发生天然免疫逃逸的重要机制。

利用乳糖化羧甲基壳聚糖构建小鼠OX40转基因细胞株

目的利用乳糖化羧甲基壳聚糖(Lac-CMCS)构建小鼠OX40转基因细胞株,探讨Lac-CMCS在HepG2细胞定向转染中的可行性。方法从Con A活化的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR方法,扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA,并将其克隆到pUCm-T载体,测序证实后构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体,利用Lac-CMCS与载体偶联靶向性转染HepG2细胞,G418筛选,RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株。结果pUCm-T-OX40和pIRES2-EGFP-OX40经PCR、酶切和测序分析,证实插入的目的片段与GenBank记载的小鼠OX40 cDNA序列完全一致。利用Lac-CMCS能将小鼠OX40靶向转染HepG2细胞并获得表达;经G418筛选后获得稳定表达小鼠OX40的细胞株。结论利用Lac-CMCS能够成功将OX40靶向转染入HepG2细胞中。

IL-21在肝癌细胞株H22细胞中的表达及其活性

目的:构建小鼠IL-21(mIL-21)真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,转染肝癌H22细胞,探讨其生物学活性。方法:RT-PCR法扩增mIL-21基因,构建mIL-21真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,并经DNA测序证实。脂质体法介导mIL-21-pcDNA3.1转染H22细胞,RT-PCR和Western boltting鉴定其表达,MTT法检测mIL-21-pcDNA3.1对T细胞增殖和NK细胞杀伤活性的影响。结果:DNA序列分析证实构建的mIL-21-pcDNA3.1正确无误,RT-PCR和Western boltting证实转染的H22细胞中有mIL-21的表达。MTT法显示,转染mIL-21的H22细胞培养上清刺激T细胞增殖的刺激指数(stimulation index,SI)为3.412±0.312,联合ConA的刺激指数为4.673±0.450,均显著高于转染空质粒组的1.465±0.103和未转染组的1.447±0.245,(P<0.01)。转染mIL-21的H22细胞培养上清NK细胞杀伤率为(81.66±4.26)%,显著高于转染空质粒组的(34.74±5.52)%和未转染对照组的(33.61±1.42)%。结论:mIL-21-pcDNA3.1载体在H22细胞中的表达可显著增强T细胞增殖及NK细胞的杀伤功能,为其在抗肝癌治疗中的应用奠定了基础。

IL-1β反义RNA在HepG2细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-antiIL1β1和pcDNA3.0-anti-IL1β2。采用阳离子聚合物(jetPEI)的方法转染HepG2肝癌细胞,RT-PCR方法检测反义RNA的表达水平,胞内因子染色的方法分析IL-1的表达水平,MTT方法分析NK-92细胞对HepG2杀伤活性的变化。结果:以LPS刺激的人PBMC总RNA为模板,RT-PCR扩增得到两个约315bp和260bp的基因片段,先构建克隆载体pMD18T-IL-1β1和pMD18T-IL-1β2,质粒PCR、XhoI酶切和DNA序列分析正确后,利用PfuDNA聚合酶进行PCR,产物纯化后经EcoRI、XhoI双酶切,反向插入pcDNA3.0,获得人IL-1β反义RNA真核表达载体pcDNA3.0-antiIL-1β1和pcDNA3.0-antiIL-1β2。PCR、PstI酶切和DNA序列分析正确后,将其分别转染HepG2细胞,RT-PCR检测显示HepG2细胞能够高水平表达两种反义RNA,胞内因子染色发现IL-1β的表达水平明显下降,同时该细胞对NK-92杀伤的敏感性明显升高,其中IL-1β1反义RNA的作用更为显著,效靶比10∶1时,NK细胞对HepG2的杀伤活性提高了约20%。结论:以促炎性细胞因子IL-1β为靶点进行干预,能够有效地下调肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力。

窒息新生儿血清IL-18及尿NAG水平变化及意义

目的探讨窒息缺氧对新生儿血清白细胞介素18(IL-18)与尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖酐酶(NAG)水平的影响。方法对28例窒息新生儿出生后第1天、治疗10天后血清IL-18、尿NAG进行测定。以20名健康新生儿作对照。结果重度窒息新生儿生后第1天血清IL-18为(175.46±41.24)pg/ml,显著高于健康新生儿的(63.29±14.28)pg/ml(P<0.01);轻度窒息组患者血清IL-18为(118.06±25.31)pg/ml,亦显著高于健康新生儿(P<0.05);治疗后两组窒息患者IL-18水平均显著下降(P<0.05)。窒息患者尿NAG与健康新生儿的比较显著升高(P<0.05)。窒自患者IL-18水平与尿NAG水平呈正相关(P<0.05)。结论窒息缺氧可导致新生儿IL-18与尿NAG水平升高;IL-18可能参与了窒息新生儿肾脏损伤的发病过程。

IL-21基因治疗小鼠H22细胞皮下移植肝癌模型的效果评价

用已构建的mIL-21/pcDNA3.1重组质粒对H22细胞建立的小鼠肝癌模型进行基因治疗,观察IL-21对小鼠体内抗肿瘤免疫应答的影响及对小鼠生存的影响。采用BALB/c小鼠左腋皮下注射腹水型肝癌细胞株H22细胞建立小鼠移植肝癌模型,给荷瘤小鼠瘤体内注射mIL-21/pcDNA3.1进行基因治疗,MTT比色法检测IL-21对荷瘤小鼠T细胞增殖水平及NK细胞杀伤活性的影响,观察治疗后荷瘤小鼠生存情况及肿瘤生长情况的改变。病理检测结果显示,成功建立了小鼠移植型肝癌模型,MTT比色法显示基因治疗后小鼠T细胞增殖水平及NK细胞杀伤活性显著升高,荷瘤小鼠肿瘤生长速度减慢,生存期显著延长。IL-21基因治疗肝癌荷瘤小鼠可显著提高荷瘤小鼠体内抗肿瘤免疫应答水平,抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期。

乙肝患者血清抗－HBe效价与HBeAg阴性变异株出现频率关系的研究

利用多聚酶链反应（ＰＣＲ）结合寡核苷酸探针杂交的方法，对７７例抗－ＨＢｅ阳性的乙肝病人血清进行了乙肝病毒（ＨＢＶ）ＨＢｅＡｇ阴性变异的分析，同时研究了血清抗－ＨＢｅ滴度与ＨＢｅＡｇ阴性变异出现频率的关系。结果１４例单独野毒株感染的病人，抗－ＨＢｅ平均效价为４．７９±１４．４５；１９例野毒株与变异株混合感染的病人，抗－ＨＢｅ平均效价为１２８．８３±２３．４４；１８例单独变异株感染的病人，抗－ＨＢｅ平均效价为２８．１８±３７．１５；２６例无ＨＢＶ复制的病人，抗－ＨＢｅ平均效价为８１．２８±２２．９１。单独野毒株感染组抗－ＨＢｅ效价显著低于混合感染组（Ｐ＜０．０１）及无ＨＢＶ复制组（Ｐ＜０．０５）。结果提示：高效价的抗－ＨＢｅ可能是选择ＨＢｅＡｇ阴性变异株的重要条件。在抗－ＨＢｅ效价高而ＨＢＶＤＮＡ仍为阳性的病人中，可能存在ＨＢｅＡｇ阴性变异株感染。

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。

窒息缺氧对新生儿血清IL-18及心肌酶水平的影响

目的:探讨窒息缺氧对新生儿血清白细胞介素18(IL-18)与心肌酶水平的影响。方法:对28例窒息新生儿出生后第1天、治疗10 d后血清IL-18、肌酸激酶同工酶(CK-MB)进行测定。以20例健康新生儿作对照。结果:窒息患儿血清IL-18、CK-MB与对照组比较明显升高,IL-18水平与CK-MB水平呈正相关。结论:窒息缺氧可导致新生儿IL-18与心肌酶水平升高;IL-18可能参与了窒息新生儿心肌损伤的发病过程。