低氧预适应对缺血再灌注损伤大鼠视网膜促红细胞生成素及活性Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察低氧预适应(hypoxic preconditioning,HPC)后视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)大鼠视网膜促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)蛋白及活性Caspase-3蛋白表达的动态变化,探讨HPC预防RIRI的机制,为RIRI的防治提供有效的治疗方案。方法取健康Sprague Dawley成年大鼠随机分为正常对照组(CON组),RIRI组与HPC+缺血再灌注损伤组(HPC组,HPC后采用高眼压法制成RIRI模型),每组根据RIRI时间分为6h、12h、24h及72h4个亚组。采用免疫组织化学法动态观察HPC对RIRI大鼠视网膜细胞EPO蛋白、活性Caspase-3蛋白表达的影响。结果 CON组大鼠视网膜仅见极少量的EPO+细胞;RIRI后6h,HPC组EPO+细胞数开始增加;RIRI后12h,HPC组EPO+细胞数(171±21)mm-2进一步增加,显著高于RIRI组[(149±20)mm-2,P<0.05];RIRI后24h,HPC组EPO+细胞数(287±24)mm-2达较高水平并显著高于RIRI组[(238±22)mm-2,P<0.01];RIRI后72h,HPC组EPO+细胞数开始下降,但仍显著高于RIRI组(P<0.05)。RIRI后6h,RIRI组活性Caspase-3+细胞数(60±5)mm-2开始增加,显著多于HPC组[(53±5)mm-2,P<0.05];RIRI后12h,RIRI组与HPC组活性Caspase-3+细胞数进一步增加,HPC组活性Caspase-3+细胞显著少于RIRI组(P<0.01);RIRI后24h,RIRI组与HPC组活性Caspase-3+细胞数达较高水平,HPC组活性Caspase-3+细胞数(578±26)mm-2显著少于RIRI组[(624±25)mm-2,P<0.01];RIRI后72h,HPC组与RIRI组活性Caspase-3+细胞数均开始下降,HPC组Caspase-3+细胞数仍少于RIRI组(P<0.05)。结论 HPC可促进RIRI大鼠视网膜细胞EPO蛋白的表达,减轻活性Caspase-3蛋白的表达,从而减轻细胞凋亡,具有神经保护作用。

视网膜下移植骨髓间充质干细胞对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响

背景:目前视网膜缺血再灌注损伤仍没有一个理想的治疗方案,组织细胞工程尤其是干细胞工程的兴起为视网膜损伤的治疗提供了新思路。目的:以视网膜电图b波、视网膜形态学、神经节细胞密度及内层视网膜厚度为指标,观察骨髓间充质干细胞视网膜下移植对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响。设计、时间及地点:完全随机对照实验,于2007-01/12在潍坊医学院眼科研究所完成。材料:选择清洁级Wistar成年大鼠48只。方法:采用密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞。将48只大鼠按随机数字表法分为4组,每组12只。缺血再灌注损伤组采用Daniel法制备视网膜缺血再灌注损伤模型;缺血再灌注损伤后24h,骨髓间充质干细胞移植组视网膜下移植Hoechst33324标记的骨髓间充质干细胞2×108L-1;磷酸盐缓冲液组输注等量的磷酸盐缓冲液;正常对照组不做任何处理。主要观察指标:缺血再灌注损伤后6h,24h,3d,7d,14d,28d动态检测各组视网膜电图b波;缺血再灌注损伤后28d荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞移植组视网膜Hoechst33324阳性细胞表达情况;缺血再灌注损伤后28d处死各组大鼠,分别对视网膜进行苏木精-伊红、尼氏染色观察,检测并比较各组神经节细胞密度及视网膜内层厚度的变化。结果:缺血再灌注损伤后各时间点缺血再灌注损伤组大鼠视网膜电图b波逐渐降低,均显著低于正常对照组(P<0.01);缺血再灌注损伤后28d骨髓间充质干细胞移植组视网膜电图b波显著高于缺血再灌注损伤组(P<0.01)。缺血再灌注损伤后28d骨髓间充质干细胞移植组视网膜各层均可见Hoechst阳性细胞,核染成蓝色。缺血再灌注损伤组视网膜神经节细胞密度与内层视网膜厚度显著小于正常对照组与骨髓间充质干细胞移植组(P<0.05～0.01),缺血再灌注损伤组与磷酸盐缓冲液组差异无显著性意义(P>0.05)。结论:视网膜缺血再灌注损伤后24h骨髓间充质干细胞视网膜下移植,可以改善视网膜电图b波、增加神经节细胞密度及内层视网膜厚度,从而达到减轻视网膜缺血再灌注损伤的目的。

MSC移植对视网膜缺血—再灌注损伤后神经节细胞中HIF-1α及Caspase-3表达的影响

目的探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)移植对视网膜缺血-再灌注损伤低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及Caspase-3表达及神经节细胞凋亡的影响,为MSC移植治疗视网膜缺血-再灌注损伤提供实验依据。方法将65只健康SD大鼠随机分为3组:正常组5只、模型组30只、MSC移植组30只,各组均将左眼作为实验眼制作视网膜缺血-再灌注损伤模型。贴壁筛选法体外培养SD大鼠MSC,模型组于缺血-再灌注1h予以玻璃体内注射PBS缓冲液,MSC移植组于缺血-再灌注后1h予以玻璃体腔注射MSC。各组SD大鼠分别于缺血-再灌注损伤后1h、6h、12h、24h、48h及72h处死,并立即摘除左眼眼球,固定包埋并切片,免疫组织化学法检测各组SD大鼠视网膜缺血-再灌注后HIF-1α及Caspase-3的表达情况。结果正常组未检测到HIF-1α及Caspase-3有表达,在视网膜缺血-再灌注后1h、6h、12h、24h、48h及72h模型组HIF-1α的表达分别为0.620±0.025、1.889±0.099、7.591±0.359、4.756±0.156、2.564±0.164、1.023±0.144;MSC移植组分别为0.222±0.058、0.774±0.162、1.831±0.124、1.567±0.059、0.930±0.010、0.583±0.065。模型组Caspase-3表达分别为0.106±0.093、0.593±0.083、1.760±0.087、3.855±0.142、2.429±0.070、1.329±0.080;MSC移植组分别为0.028±0.004、0.180±0.032、0.887±0.0075、1.857±0.050、1.554±0.079、0.957±0.087。与模型组相比,MSC移植组HIF-1α及Caspase-3的表达明显减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论视网膜缺血-再灌注损伤后行MSC玻璃体内注射可抑制神经节细胞HIF-1α及Caspase-3的表达,减少神经节细胞的凋亡,对视网膜缺血-再灌注损伤有一定的保护作用。

骨髓间充质干细胞移植对缺血-再灌注损伤视网膜中Fas／FasL及caspases-3表达的影响

背景视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）严重影响视力，其损伤机制是视网膜细胞的凋亡，治疗效果不佳。研究证实骨髓间充质干细胞（BMSCs）视网膜下移植后可显著减轻RIRI，而BMSCs视网膜移植所产生的神经保护机制是否与其抑制凋亡作用有关目前尚不清楚。目的观察BMSCs视网膜下移植对RIRI大鼠视网膜中凋亡相关因子Fas／FasL和caspases-3蛋白表达的影响，探讨BMSCs移植治疗RIRI的神经保护机制。方法无菌条件下分离SD大鼠的股骨和胫骨骨髓，离心收集细胞后用DMEM低糖培养液制成骨髓细胞悬液，体外培养大鼠BMSCs，并以1×10^6～2×10^6个／ml的细胞密度和1：2进行传代。64只清洁级健康成年SD大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、BMSCs移植组及PBS对照组，每组16只。用视神经线栓法制备大鼠视网膜RIRI模型，BMSCs移植组大鼠于造模后24h视网膜下注入5×10^4个活BMSCs，PBS对照组以同样的方式注入PBS。用颈椎脱臼法处死大鼠，制备16μm厚视网膜切片。采用免疫组织化学法动态观察BMSCs移植后6、24、48、72h各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3蛋白表达的变化。结果BMSCs视网膜下移植后72h，荧光显微镜观察可见视网膜下Hoechst33324阳性细胞。BMSCs视网膜下移植后6、24、48、72h，正常对照组大鼠视网膜仅见微量Fas、FasL和caspase3的阳性表达；BMSCs视网膜下移植后各时间点，模型对照组与BMSCs移植组大鼠视网膜均可见Fas、FasL、caspase-3阳性表达细胞，免疫组织化学染色强度和细胞数量值均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。随着BMSCs移植时间的延长，各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3阳性细胞数均逐渐下降，各时间点BMSCs移植组大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3的阳性表达值均明显低于模型对照组和PBS对照组大鼠，差异均有统计学意义（P〈0．05），但各时间点模型对照组与PBS对照组间大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3阳性细胞数变化的差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论视网膜下移植BMSCs可下调RIRI大鼠视网膜中凋亡相关蛋白Fas、FasL及caspase-3的表达，从而减轻RIRI大鼠视网膜神经节细胞的凋亡。

人脐血单个核细胞移植在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的迁移及分化

背景:研究发现脐血单个核细胞脑内移植后可以存活,并减轻缺氧缺血性脑损伤程度,显著改善脑损伤大鼠的远期行为学,但作用机制仍未阐明。目的:将人脐血单个核细胞经侧脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内,观察植入细胞在脑内的迁移与分化。设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2007-12/2008-08在潍坊医学院分子影像学研究中心完成。材料:脐血来源于健康、足月妊娠产妇,由潍坊医学院附属医院产科提供。清洁级健康7d龄SD新生大鼠50只,由山东省中医药大学动物中心提供。方法:Ficoll法体外分离培养人脐血单个核细胞,移植前3d行BrdU标记。50只大鼠均采用Rice-Vannucci法复制缺氧缺血性脑损伤模型,造模后24h,在左侧侧脑室(AP:-0.5mm,ML:-2mm,DV:-2mm)注入脐血单个核细胞悬液,2μL/点,共1×105个活细胞。分别于细胞移植后24h,3d,7d,14d,28d取材制备脑组织切片,10只/时间点。主要观察指标:采用免疫荧光双标法检测移植脐血单个核细胞的脑内迁移、神经干细胞的表达、分化情况。结果:50只大鼠均进入结果分析。①移植后24h侧脑室内可见BrdU+细胞;移植后3,7d移植细胞迁移到室管膜下区;移植后14,28d移植细胞迁移到大脑皮质及海马。②移植后24h侧脑室内可见BrdU+nestin+细胞;移植后3d室管膜下区出现BrdU+nestin+细胞;移植后7dBrdU+nestin+细胞数增加;移植后14dBrdU+nestin+细胞数下降。③移植后14d大脑皮质、海马开始出现BrdU+NSE+细胞与BrdU+GFAP+细胞,移植后28d双阳性细胞数进一步增加,BrdU+NSE+细胞及BrdU+GFAP+细胞占BrdU+的比例也增加。结论:脐血单个核细胞侧脑室移植入脑内后可以继续存活,并迁移到大脑皮质与海马部位,分化为成熟的神经元与神经胶质细胞。

视网膜缺血再灌注损伤骨髓间充质干细胞移植途径的探讨

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗大鼠视网膜缺血再灌注损伤的最佳途径。方法Sprague-Dawley大鼠48只,随机分为正常对照组(CON)、视网膜缺血再灌注损伤(IR)组、视网膜下移植(ST)组与玻璃体腔内移植(VT)组,12只/组。缺血再灌注损伤后6h、24h、72h、7d、14d和28d,动态检测各组ERGb波;缺血再灌注损伤后28d,采用HE与尼氏染色法检测各组RGC密度及内层视网膜厚度的变化。结果IR组缺血再灌注后,ERGb波下降,缺血再灌注后72h,IR组ERGb波降到最低幅值,缺血再灌注后28d,ST组与VT组ERGb波高于IR组(P<0.01);HE染色光镜下观察,IR组视网膜神经节细胞减少,内层视网膜变薄,ST组与VT组节细胞层神经节细胞较多,视网膜内层较厚;IR组视网膜神经节细胞密度较小,内层视网膜厚度较薄,均低于ST组与VT组(P<0.01),ST组视网膜神经节细胞密度与内层视网膜厚度均高于VT组(P<0.05)。结论骨髓MSCs视网膜下移植与玻璃体腔内移植均能显著减轻视网膜缺血再灌注损伤,骨髓MSCs视网膜下移植治疗效果较为显著。

骨髓间充质干细胞对脑缺血大鼠神经干细胞分化的影响

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞(NSCs)分化的影响,为BMSCs移植治疗局灶性脑缺血性疾病提供科学的理论依据。方法采用完全随机法将40只Sprague-Dawley大鼠分为正常对照(CON)组、大脑中动脉阻塞模型(MCAO)组、BMSCs移植组与磷酸盐缓冲液(PBS)组。贴壁法体外培养大鼠BMSCs,采用线栓法制成大鼠局灶性脑缺血模型,造模后24h侧脑室移植BMSCs,腹腔注射5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)标记增殖细胞。移植后28d,采用BrdU/3-tubulin与BrdU/GFAP免疫荧光双标法检测BMSCs移植对内源性NSCs分化的影响,并采用尼氏染色法观察各组大鼠损伤侧脑组织神经元的变化。结果移植后28d,MCAO组可见少量BrdU^+β-tubulin^+细胞,显著少于CON组(P<0.01),PBS组与MCAO组BrdU^+β-tubulin^+细胞差异无显著性(P>0.05),BMSCs移植组可见大量BrdU^+β-tubulin^+细胞,显著高于MCAO组(P<0.01)与PBS组(P<0.01);MCAO组可见大量BrdU^+GFAP^+细胞,显著高于CON组(P<0.01),PBS组与MCAO组BrdU^+β-tubulin^+细胞差异无显著性(P>0.05),BMSCs移植组可见少量BrdU^+GFAP^+细胞,显著低于MCAO组(P<0.01)与PBS组(P<0.01)。MCAO组大鼠损伤侧大脑皮层神经元细胞数明显少于CON组(P<0.01),PBS组与MCAO组差别不显著(P>0.05);BMSCs移植组大鼠大脑皮层神经元细胞数显著多于MCAO组,差异具有统计学意义(P<0,01)。结论 BMSCs可促进局灶性脑缺血大鼠内源性NSCs分化成为成熟的神经元与星形胶质细胞,修复脑损伤。

低氧预适应对缺血再灌注损伤大鼠视网膜低氧诱导因子-1α和血红素氧合酶-1表达的影响

目的观察低氧预适应(hypoxic preconditioning,HPC)后视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)大鼠视网膜低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的动态变化。方法取65只Wistar成年大鼠随机分为正常对照组5只,RIRI组30只,HPC+RIRI组30只(HPC后采用高眼压法制成RIRI模型),后两组于RIRI后6 h、12 h、24 h、36 h、3 d、7 d各处死5只鼠。采用尼氏染色观察HPC对各组大鼠视网膜的影响,免疫组织化学法动态观察HPC对RIRI大鼠视网膜HIF-1α、HO-1表达的影响。结果尼氏染色显示正常对照组大鼠视网膜结构清晰,各层细胞排列整齐紧密;RIRI组大鼠视网膜各层高度水肿,随着时间延长,神经节细胞数量逐渐减少,分布较紊乱、稀疏;HPC+RIRI组与RIRI组比较,各层细胞水肿明显减轻,细胞排列比较规整,神经节细胞数量减少降低,分布较整齐。正常对照组大鼠视网膜组织HIF-1α、HO-1微量表达。RIRI组HIF-1α表达升高,峰值在RIRI后12 h,阳性细胞数为(120.64±5.67)个·mm-2;RIRI后6 h起HPC+RIRI组HIF-1α表达较RIRI组升高,RIRI后12 h达高峰且阳性细胞数为(158.54±4.77)个·mm-2,24 h起逐渐下降,RIRI后7 d时HPC+RIRI组HIF-1α表达仍高于RIRI组;RIRI后RIRI组HO-1表达升高,峰值在RIRI后24 h且阳性细胞数为(129.54±4.58)个·mm-2;RIRI后6 h起HPC+RIRI组HO-1表达较RIRI组升高,RIRI后12 h达高峰且阳性细胞数为(157.56±4.67)个·mm-2,RIRI后24 h仍高表达且阳性细胞数为(150.78±4.97)个·mm-2,此后逐渐下降,RIRI后7 d,HPC+RIRI组仍明显高于RIRI组。与RIRI组比较,HPC+RIRI组RIRI后各时间点HIF-1α、HO-1阳性细胞数均增多,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 HPC可促进RIRI大鼠视网膜HIF-1α、HO-1蛋白的表达,减轻视网膜损伤,具有视网膜保护作用。

骨髓间充质干细胞移植对视网膜病变新生大鼠视网膜细胞凋亡的影响

目的探讨早产儿视网膜病变(ROP)大鼠玻璃体内注射骨髓间充质干细胞(BMSCs)对视网膜细胞凋亡及视网膜中神经营养素-3(NT-3)、睫状神经营养因子(CNTF)表达的影响。方法 40只7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为正常对照组、ROP模型组、骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植组与磷酸缓冲液组(PBS组),每组10只。采用高氧法制成ROP模型,持续高氧5 d后分别给予BMSCs移植组与PBS组玻璃体内注射BMSCs和PBS。移植7 d后,采用TUNEL/DAPI、NT-3/DAPI、CNTF/DAPI免疫荧光双标法观察BMSCs移植对视网膜细胞凋亡及NT-3、CNTF表达的影响。结果移植7 d后,正常对照组视网膜几乎未见TUNEL+DAPI+细胞,BMSCs移植组视网膜可见少量TUNEL+DAPI+细胞,显著低于ROP模型组与PBS组(P<0.01),而ROP模型组与PBS组差异无统计学意义(P>0.05);正常对照组视网膜可见极少量的NT-3+DAPI+与CNTF+DAPI+细胞,ROP模型组与PBS组大鼠视网膜可见少量NT-3+DAPI+与CNTF+DAPI+细胞,较正常对照组增多,但差异无统计学意义(P>0.05);BMSCs移植组大鼠视网膜NT-3+DAPI+与CNTF+DAPI+细胞数均显著多于ROP模型组与PBS组(P<0.01),而ROP模型组与PBS组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs移植可减轻ROP大鼠视网膜细胞的凋亡,其机制可能与其促进ROP大鼠视网膜细胞NT-3与CNTF的表达有关。

高压氧治疗对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

目的探讨高压氧（HBO）治疗缺氧缺血性脑损伤新生大鼠后，内源性神经干细胞增殖的动态变化。方法将7日龄Sprague—Dawley新生大鼠随机分为正常对照组（对照组）、缺氧缺血脑损伤组（模型组）与HBO治疗组（HBO组）。采用经典的Rice-Vannucci法制作缺氧缺血性脑损伤模型，HBO组在脑损伤后3h内进行HBO治疗，治疗压力为2个绝对大气压，稳压60min，每日1次，连续7d。分别于HBO治疗后第3小时、第21小时、第3天、第7天和第14天，采用5-溴-2-脱氧脲苷（BrdU）／巢蛋白免疫荧光双重标记法动态检测缺血侧侧脑室室管膜下区与海马齿状回内源性神经干细胞增殖的动态变化；采用Western blot法检测缺血侧大脑半球巢蛋白的动态变化。结果HBO组室管膜下区与海马齿状回BrdU^＋／巢蛋白标记的神经干阳性细胞数分别于HBO治疗后第3小时及第21小时显著增加，第7天达最高水平，并显著高于模型组和对照组（P〈0．01），第14天BrdU^＋／巢蛋白阳性细胞数开始下降，仍高于模型组和对照组（P〈0．01）；巢蛋白的Western blot分析发现，缺血侧大脑半球巢蛋白于HBO治疗后第21小时开始增加，第7天达峰值后下降。结论缺氧缺血性脑损伤后3h内给予HBO治疗，可以促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的增殖。

脐血单个核细胞移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的影响

新生儿缺氧缺血性脑病是新生儿一常见疾病，可以导致脑瘫、癫痫、智力低下等严重后遗症，给家庭与社会带来沉重负担，目前尚无特效治疗，因此寻找一种有效的治疗方案是目前研究的重点。近年来脐血库及干细胞工程的兴起为其治疗带来希望。近日研究发现脐血单个核细胞脑内移植可以存活，且可以促进其远期行为学与组织学的恢复，

高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内β-连接素活化的影响

目的探讨高压氧（HBO）治疗后缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠神经干细胞增殖与β-连接素（β-catenin）蛋白的关系。方法共选取7日龄SD新生夫鼠180只，将其分为正常对照组（对照组）、模型组及HBO组。采用Rice法制作HIBD模型，HBO组于造模后3h内给予HBO治疗，治疗压力为2个绝对大气压，稳压60min，每日治疗1次，连续治疗7d；模型组制模后不给予任何处理。于HBO治疗后第3、21小时，第3、5、7及14天时采用巢蛋白／β-catenin免疫荧光双标法动态检测各组大鼠侧脑室室管膜下区巢蛋白、β-catenin蛋白表达，并对p—eatenin与巢蛋白的荧光强度进行相关性分析；采用Westernblot法检测各组大鼠左侧脑组织β-catenin总蛋白与核蛋白的表达情况。结果免疫荧光双标结果显示HBO治疗后第21小时时，HBO纠与模型组神经干细胞内β-catenin蛋白表达开始增强；HBO治疗后第5天时，HBO组β-catenin蛋白表达达到较高水平并显苫高丁模型组（P〈0．01）；HBO治疗后第14天时，HBO组β-catenin蛋白表达显著减少；HBO组巢货门表达于HBO治疗后第21小时时开始增强，于治疗后第7天时达到较高水平，显著高于模型组（P〈0．05）。另外本研究还发现HBO组β-catenin蛋白与巢蛋白荧光强度具有直线相关性（r^2=0．66，P〈0．01）；Western blot结果显示HBO组β-catenin总蛋白及核蛋白均于HBO治疗后第5天时达到较高水平，并显著高于模型组（P〈0．05）。结论HBO治疗可促进HIBD新生大鼠神经于细胞增殖，其治疗机制可能与促进β-catenin蛋白活化有关。