TGF-β1调控基质金属蛋白酶-20(MMP-20)启动子转录活性的研究

目的:克隆MMP-20基因启动子序列,分析转化生长因子-β1对其转录活性的影响。方法:检索并分析MMP-20基因翻译起始点上游序列。利用PCR从小鼠基因组上扩增长度为2852bp的启动子序列,并与pMD18-T克隆载体连接。经酶切反应初步鉴定后,以pMD18-T-MMP-20为模板,利用PCR方法获得带酶切位点的MMP-20启动子片段(2842bp),并与pGL3-Basic载体连接。pGL3-MMP-20瞬时转染小鼠成釉细胞系(ALC)过夜后,在培养基中加入1ng/mLTGF-β1,12h后检测荧光素酶的活性。结果:经酶切反应和测序结果证实MMP-20启动子成功插入pGL3-Basic质粒。与pGL3-Basic质粒转染相比较,转染pGL3-MMP-20后荧光素酶活性明显增强;培养基中加入TGF-β1能促使pGL3-MMP-20荧光素酶活性进一步增强。结论:外源性MMP-20启动子在成釉细胞中被激活;TGF-β1能增强pGL3-MMP-20荧光素酶活性,提示釉质发育过程中,TGF-β1具有调节MMP-20基因表达的生物学功能。

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。

c-Jun调控成釉细胞Amelotin基因表达的研究

目的:通过过表达及knockdown c-Jun基因,观察小鼠成釉细胞中釉成熟蛋白(amelotin)的表达变化,以初步确定c-Jun对amelotin的调控作用。方法:①应用免疫组化和细胞免疫荧光方法观察体内外成釉细胞中的c-Jun及amelotin的表达情况;②RT-PCR获得c-Jun基因,克隆至pcDNA3.1/myc-hisA,瞬时转染成釉细胞,real time RT-PCR观察其对amelotin表达的影响;③化学合成c-Jun siRNA,瞬时转染成釉细胞,re-al time RT-PCR观察其对amelotin表达的影响。结果:①体内外成釉细胞中c-Jun和amelotin均有表达,c-Jun主要在成釉细胞胞核中表达,amelotin在成釉细胞和釉质全层均有表达;②成功构建c-Jun真核重组表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-c-Jun,转染成釉细胞后amelotin mRNA表达水平显著上升;③成功沉默c-Jun,amelotin在转染c-Jun siRNA组表达水平显著下降。结论:在成釉细胞中,c-Jun在转录水平调控amelotin基因的表达。

TGF-β1调控成釉细胞ODAM基因表达的研究

目的:探讨TGF-β1对ODAM基因表达的作用。方法:通过实时定量RT-PCR法观察TGF-β1对成釉细胞ODAM基因表达的影响;利用c-jun小RNA干扰(siRNA)技术,阻断转录因子c-jun基因表达,观察c-jun基因沉默对TGF-β1诱导ODAM基因表达的影响;利用双荧光素酶基因报告系统研究成釉细胞中TGF-β1对ODAM启动子转录活性的调控作用。结果:TGF-β1刺激成釉细胞后,ODAM基因表达显著增强;利用小RNA干扰技术使c-jun基因沉默,实时定量RT-PCR法研究显示,TGF-β1调控ODAM基因表达的作用减弱。将pGL3-ODAM转染成釉细胞后,用TGF-β1刺激成釉细胞一定时间,ODAM启动子的转录活性增强。c-jun基因沉默抑制了TGF-β1对ODAM启动子的激活作用。结论:在釉质发育过程中,TGF-β1通过转录因子c-jun调控成釉细胞ODAM基因表达。

Runx2调控成釉细胞Amelotin基因表达的研究

目的:研究Runx2与Amelotin基因表达之间的关系,并寻找Runx2在Amelotin启动子上重要的结合位点。方法:利用免疫组化方法定位Runx2与Amelotin在体内的表达;通过RNA干扰和过量表达Runx2的方法,改变Runx2在成釉细胞中的表达量;利用qRT-PCR的方法检测Runx2表达量的改变对Amelotin基因表达的影响;利用软件分析Amelotin启动子近端区域Runx2的可能结合位点后,以PCR方法获取含有该位点的Amelotin基因上游启动子片段,进一步克隆含有该位点的Amelotin启动子荧光报告载体pGL3-Amtn-1463,并对该位点进行定点突变,以此瞬时转染成釉细胞,通过检测荧光素酶活性来分析定点突变对该段启动子转录活性的影响。结果:Runx2在成釉细胞核中有表达,而Amelotin在成釉细胞分泌的牙釉基质中有表达;过量表达或降低表达Runx2时,Amelotin的表达也受到相应影响;成功克隆pGL3-Amtn-1463和pGL3-Amtn-1463-Runx2mut并瞬转染成釉细胞发现,潜在的Runx2结合位点的突变能降低Amelotin启动子的转录活性。结论:-1342/-1336区域的Runx2结合位点在Runx2调控Amelotin基因表达过程中具有重要作用。

人牙釉质蛋白Amelotin,Ameloblastin及Enamelin基因启动子的初步研究

目的分析人釉成熟蛋白(Amelotin,AMTN)、成釉蛋白(Ameloblastin,AMBN)与釉蛋白(Enamelin,ENAM)基因上游启动子序列,构建不同长度的基因上游启动子报告基因载体,为进一步判断启动子序列的转录调控区奠定基础。方法利用软件分析基因启动子序列,以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中。结果成功地获得了不同长度的Amelotin,Ameloblastin及Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功。结论成功构建了不同长度启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,为进一步研究牙釉质蛋白基因启动子的转录活性及转录调控特点奠定基础。

釉成熟蛋白和釉原蛋白基因在小鼠牙胚发育过程中的时空表达研究

目的：观察、比较小鼠釉成熟蛋白（amelotin）和釉原蛋白（amelogenin）基因在牙齿发育过程中的表达。方法：利用Digoxigenin标记的cRNA探针，采用原位杂交技术对amelotin和amelogenin基因表达进行组织学定位；然后从小鼠下颌中提取总RNA，采用RT—PCR技术观察小鼠amelotin和amelogenin基因在小鼠下颌组织中的表达。结果：在出生后1d的小鼠下颌第一磨牙，随着前期牙本质形成，amelogenin在成釉细胞层开始表达，并逐渐增强，但未检测到amelotin基因表达；在出生后5d的小鼠，成釉细胞处于分泌期，amelotin和amelogenin基因在成釉细胞中显著表达；在出生后10d小鼠下颌第一磨牙，amelotin和amelogenin基因在牙尖周围成熟期成釉细胞中的表达信号明显降低。利用RT—PCR技术，在新生小鼠下颌中未检测到amelotin基因表达，但amelogenin已开始表达；从出生1—7d小鼠下颌中均检测到amelotin和amelogenin基因表达；在出生后7d小鼠，amelogenin表达显著下降。结论：amelotin和amelogenin均参与了釉质发育过程；amelotin基因表达迟于amelogenin基因，提示两种釉质基质蛋白在釉质发育过程中可能发挥不同生物学作用。

人釉蛋白基因启动子在成釉细胞中的转录活性研究

目的构建人釉蛋白(Enamelin,ENAM)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,通过分析不同的启动子片段的活性,确定启动子的功能区域,为进一步研究Enamelin基因的转录调控机制奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在成釉细胞中活性不同,-1216～-554与-312～-133区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Enamelin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Enamelin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Enamelin基因转录调控特点奠定基础。

置管引流冲洗术治疗颌骨巨大囊性病变的应用与研究

目的探讨置管引流冲洗术治疗颌骨巨大囊性病变的治疗效果。方法病例选自课题组成员医院口腔科就诊的临床表现和影像学表现符合颌骨巨大囊性痛变患者104例。在临床上随机分为实验组（置管引流冲洗术）和对照组（常规手术）。结果比较两组术后两年的疗效，P〈0．05为差异有显著性。结论置管引流冲洗术手术简单，可在局麻下完成，创伤小，既根除了病变，修复了面部的膨隆畸形，又最大限度地保存颌骨的连续性，避免了因切除过多的组织给患者带来的巨大痛苦，患者容易接受，尤其是风险低，经济性好，术后复发率低，较传统手术有明显优越性。

甲状旁腺素1受体(PTH1R)调控成釉细胞MMP-20基因表达的分子机制研究

目的通过进行甲状旁腺素l受体(PTH1R)基因克隆以及真核表达载体的构建,分析PTH1R对成釉细胞MMP-20基因表达的影响.为进一步探讨PTH1R在牙釉质形成以及发育过程中的分子调控方面奠定基础。方法根据引物设计原则设计PTH1R基因的RT-PCR引物,用PCR法扩增得出含有EcoRⅠ和XhoL的PTH1R目的基因片段。通过T4连接酶连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上。并用双荧光素酶报告基因系统检测MMP-20启动子区域的转录活性。结果①经过PCR引物扩增得到1794BP的基因片段,将获得的重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-PTH1R双酶切分析鉴定,测序结果与GenBank登录基因完全一致。②经双荧光素酶报告基因系统检测得出PTH1R能够上调MMP-20基因的表达水平。结论成功实现了PTH1R基因克隆及真核表达载体的构建,初步证明了PTH1R可能调控MMP-20基因的表达。

EGF与TGF-β1调控MMP20基因表达的研究

目的观察表皮生长因子(EGF)与TGF-β1对小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(MMP20)基因表达的调控作用,并探讨其分子作用机制。方法利用Real time-PCR法分析EGF,TGF-β1对成釉细胞MMP20基因表达的影响;阻断MAPK通路,利用Real time-PCR法分析EGF,TGF-β1对MMP20基因表达的影响;利用双荧光素酶基因报告系统分析EGF,TGF-β1对成釉细胞MMP20基因启动子转录活性的影响。结果与对照组相比,EGF与TGF-β1均显著上调MMP20基因表达;加入MAPK抑制剂后,显著抑制了EGF与TGF-β1对MMP20基因表达的作用。双荧光素酶报告基因检测系统显示:与对照组相比,EGF与TGF-β1显著促进MMP20基因启动子的转录活性。结论 EGF通过P38通路与ERK通路上调MMP20的表达;TGF-β1通过p38通路与JNK通路上调MMP20的表达。

转录因子JunB和JunD调控成釉细胞MMP-20基因转录活性的研究

目的通过研究转录因子JunB,JunD对成釉细胞中MMP-20基因表达的调控作用,从而进一步明确Jun家族在牙釉质形成中的影响。方法首先构建JunB和JunD真核表达载体重组质粒并瞬时转染重组质粒进入成釉细胞中;利用双荧光素酶基因检测报告系统分析不同浓度JunB,JunD对MMP-20启动子特征性序列区域的转录活性的影响;确定有明显作用的启动子区段,利用基因定点突变和双荧光素酶基因检测报告系统分析JunB对MMP-20基因启动子转录活性的影响;最后再观察JunB与JunD共转染时对MMP-20基因活性表达的改变。结果成功构建JunB,JunD真核重组表达载体,顺利将重组质粒转染入成釉细胞;双荧光素酶基因检测报告系统分析显示JunB对MMP20启动子活性表达上调,而JunD对MMP20启动子活性表达无作用;突变MMP20启动子AP1的两个结合位点后,MMP20启动子的转录活性下降,同时JunB也失去了上调MMP20启动子转录活性的作用。最后将JunB和JunD共转染时,在JunB存在的前提下,随着JunD转染量的增加,小鼠成釉细胞MMP20启动子转录活性明显减弱。结论该研究表明转录因子JunB与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP20的表达水平;而JunD对MMP20启动子特征性序列无明显作用。所以为进一步研究Jun家族成员在釉质发育过程中的作用建立了重要的生物学基础。

SPDEF调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的分子机制研究

目的通过克隆转录因子SPDEF以及其真核表达载体的构建,分析该基因对成釉细胞MMP-20基因表达的影响,为进一步研究转录因子SPDEF在牙釉质形成中发挥的作用奠定基础。方法利用RT-PCR技术从小鼠成釉细胞中获得SPDEF基因,测序正确后克隆至pcDNA3.1/myc-HisA载体中,将重组质粒瞬时转染成釉细胞,并用双荧光素酶报告基因系统检测技术来检测MMP-20启动子区域的转录活性。结果①SPDEF基因经过RT-PCR扩增得到的产物与预期片段978bp相符,将所获得的目的基因与GenBank提供的已知序列(NM:013891.4)完全一致。②重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-SPDEF转染成釉细胞后,用荧光素酶分析系统检测显示MMP-20启动子转录活性升高。结论成功构建了SPDEF真核表达载体,初步研究证明SPDEF可能与MMP-20特征性序列结合从而上调MMP-20的表达。

釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定

目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin),制备多克隆抗体,并进行初步鉴定。方法:RT-PCR获得Amelo-tin成熟肽片段,构建pET32a-Amelotin,IPTG诱导表达Amelo-tin,纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体滴度。Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性。结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1∶12800。Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin,免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用。结论:以纯化的Amelo-tin为免疫原,成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelo-tin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础。

釉成熟蛋白amelotin在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:观察釉成熟蛋白(amelotin)基因聚合酶链反应产物在大肠杆菌中的表达,并获得纯化的釉成熟蛋白。方法:利用His融合蛋白表达载体pET32a(+)转化大肠杆菌BL21,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并改变诱导时间、温度、IPTG浓度来优化表达条件,然后在优化的条件下进行大量表达并收菌;His镍柱纯化表达的蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白表达、纯化情况。结果:电泳结果分析表明:amelotin PCR扩增产物在大肠杆菌中获得高效表达,大小约4×104,纯化得到的amelotin纯度较高。结论:成功得到纯化的amelotin,为进一步制备抗体奠定基础。

骨涎蛋白、骨桥蛋白在小鼠骨组织和牙胚组织发育中的表达

目的:探讨骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在小鼠骨组织和牙胚组织发育过程中的分布特点及两者在骨组织形成和牙矿化过程中的作用。方法:取E16d胎鼠及出生后第10、30天的BALB/c小鼠共9只,拉颈处死,分离解剖下颌骨及其他骨组织,新鲜配制4%多聚甲醛固定过夜,常规石蜡包埋,近、远中向5μm连续切片,采用免疫组化法检测E16d胎鼠不同骨组织及10d、30d小鼠牙胚组织中BSP、OPN的表达及分布情况。结果:BSP、OPN在牙胚及骨组织发育中的分布模式存在差异。BSP在已经矿化成熟的矿化组织基质中呈阳性表达,而OPN主要在矿化的前沿及矿化活性强的矿化组织中强阳性表达。结论:BSP、OPN参与骨组织的发育和牙胚组织的矿化成熟,并在小鼠牙及骨组织的形成和矿化中具有重要作用。

人牙成釉细胞相关蛋白启动子的克隆和转录活性分析

目的:构建人牙成釉细胞相关蛋白(odontogenic ameloblast-asssociated protein,ODAM)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,比较不同的启动子片段在成釉细胞、Hela细胞中的活性,为进一步判定上游启动子的转录调控区奠定基础。方法:以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果:成功地获得了不同长度的ODAM基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在不同的细胞中活性不同,-333～-195与-195～-96区域为特异的转录调控作用区。结论:初步确定了ODAM基因启动子的转录活性区,为进一步研究该基因转录调控特点奠定基础。

Tet-on Advanced调控Amelotin基因表达成釉细胞系的建立

目的应用Tet-on Advanced基因表达系统构建由强力霉素(Dox)诱导Amelotin基因表达的成釉细胞系,为进一步研究Amelotin基因的生物学功能奠定基础。方法通过RT-PCT法从出生后7d的小鼠牙胚中克隆得到Amelotin的全长基因,测序正确后将其亚克隆入pTRE-Tight载体中,利用Tet-on Advanced基因表达系统先后将调控质粒pTet-on Advanced和反应质粒pTRE-Tight-Amelotin转入成釉细胞,分别用G418和潮霉素进行筛选,克隆扩增得到可诱导表达Amelotin基因的成釉细胞系。用RT-PCR法检测不同Dox浓度下转染成釉细胞中Amelotin基因的表达。结果连续两个回合的转染及筛选后获得了引入pTet-on Advanced系统的细胞系,能够高诱导低背景表达Amelotin,在强力霉素诱导48h可以使Amelotin的表达显著增加,强力霉素在一定浓度范围内可以诱导Amelotin的表达呈剂量依赖性增加。结论成功构建了受强力霉素调控的双重稳定表达Amelotin成釉细胞系,为进一步研究Amelotin与釉质矿化之间的关系奠定了基础。

FGF2对成骨细胞矿化及矿化基因ENPP1，ANK和TNAP表达的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）对分化不同阶段的成骨细胞（MC3T3．E1）矿化基因ENPP1，ANK和TNAP表达的影响，从细胞和分子水平上探讨FGF2对成骨细胞矿化的机制。方法构建不同分化阶段的MC3T3-E1细胞，诱导前为未分化阶段，矿化诱导后为分化阶段。50μg／LFGF2分别作用于未分化和分化阶段的MC313-E1细胞，测定细胞内碱性磷酸酶表达情况，用茜素红染色法观察MC3T3-E1细胞矿化结节的变化，实时荧光定量RT—PCR检测细胞矿化基因ENPP1，ANK和TNAP表达的差异并进行统计学分析。结果 茜素红染色显示FGF2抑制MC3T3-E1细胞的矿化。FGF2作用于未分化的MC3T3-E1细胞，ENPPl，ANK基因表达明显上调，TNAP基因表达明显下调；而FGF2作用于分化的MC3T3-E1细胞后基因表达变化不明显、结论体外细胞研究显示，FGF2可能是通过调节焦磷酸盐加工因子ENPPI，ANK，TNAP基因表达的变化来抑制MC3T3-E1细胞的矿化过程．

慢性牙周炎患者牙龈组织中TNF-αmRNA的表达

目的观察健康牙周组织与手术前慢性牙周炎患者的牙龈组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平,并探讨其临床意义。方法采用RT-PCR方法,检测了40例样本(20例健康者,20例中重度慢性牙周炎患者),分析TNF-α在牙龈组织中的表达水平。结果 TNF-α分布于健康牙龈和牙周炎患者的牙龈组织中,但慢性牙周炎患者牙龈组织中TNF-α的表达水平显著高于健康者牙龈组织(P<0.01)。结论 TNF-α参与了慢性牙周炎的病理过程。