靶向成纤维细胞活化蛋白通过影响肿瘤相关成纤维细胞的外泌体抑制内皮细胞间质转化

目的探讨特异性抑制成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是否能够通过影响肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)的外泌体(exosomes,exo)抑制内皮细胞间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)并探究其机制。方法提取原代CAFs和癌旁成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs),收集CAFs-exo和PTFs-exo,特异性FAP抑制剂(3.3 nmol·L^(-1)SP13786)处理CAFs 24 h后收集的外泌体命名为Anti-FAP-exo。将内皮细胞HMEC-1分别以等体积的RPMI 1640、PTFs-exo、CAFs-exo及Anti-FAP-exo孵育并命名为control组、PTF组、CAF组及Anti-FAP组。划痕实验、Transwell侵袭实验、血管生成实验检测各组HMEC-1细胞的迁移、侵袭及血管生成能力;免疫荧光、免疫组化和Western blot检测EndMT相关蛋白表达水平。结果CAF组HMEC-1细胞的迁移、侵袭及血管生成能力较PTF组明显增强,Anti-FAP组HMEC-1细胞迁移、侵袭及血管生成能力较CAF组明显减弱,与PTF组比较无差异。与PTF组相比,CAF组HMEC-1细胞高表达α-SMA、SM22α、p-Stat3和Snail,低表达CD31和VE-cadherin;与CAF组相比,Anti-FAP组HMEC-1低表达α-SMA、SM22α、p-Stat3和Snail,高表达CD31和VE-cadherin。结论特异性抑制FAP会通过影响CAFs外泌体间接抑制血管内皮细胞的迁移侵袭与成管能力,Stat3-Snail-EndMT可能是其潜在机制。

大豆异黄酮心血管作用的研究进展

异黄酮是一类具有雌激素样作用的生物活性物质。大豆中的异黄酮主要有两种形式 :染料木黄酮和黄豆苷原。近年来发现 ,大豆异黄酮具有较强的抗动脉粥样硬化和舒血管效应 ,影响细胞增殖和新生血管的形成 。

餐后不适综合征患者血浆Motilin与Ghrelin水平的测定

目的探讨血浆中Motilin与Ghrelin含量的变化与餐后不适综合征(Postprandial Distress Syndrome,PDS)型功能性消化不良的关系。方法将32例餐后不适综合征患者进行临床症状积分评价,分为轻、中、重三组。采用ELISA法测定32例餐后不适综合征患者血浆中Motilin与Ghrelin的含量,判断血浆中Motilin和Ghrelin的含量与餐后不适综合征发病及疾病严重程度的关系。结果餐后不适综合征患者血浆中Motilin与Ghrelin水平显著低于正常对照组(P<0.01),且临床症状积分高者明显低于临床症状积分低者(P<0.05)。结论餐后不适综合征患者血浆Motilin与Ghrelin水平降低,并与临床症状的严重程度密切负相关。

氟芬那酸丁酯软膏治疗面部单纯糠疹40例疗效观察

目前单纯糠疹发病机制尚不完全清楚，可能与日晒和皮肤干燥有关，笔者于2011年2~10月对本科门诊确诊的80例单纯糠疹患者进行研究，现报道如下。

多柔比星通过Stat3-Oct-4/CD44途径诱导三阴性乳腺癌4T1细胞干性的产生

目的:观察多柔比星对三阴性乳腺癌细胞干性的诱导作用并研究其作用机制。方法:用不同终浓度(0、0.05、0.1和0.5μmol/L)多柔比星培养细胞,观察细胞形态及存活情况,筛选出最适多柔比星浓度(0.1μmol/L)用于后续实验。小鼠乳腺癌4T1细胞和人乳腺癌MDA-MB-468细胞经多柔比星(0.1μmol/L)持续刺激4周后分别命名为4T1-DOX和MDA-MB-468-DOX细胞。通过成球实验观察细胞的干性,免疫荧光检测CD133的表达,流式细胞术检测CD44的表达,Western blot检测Stat3、p-Stat3和Oct-4的表达。结果:成球实验发现4T1-DOX细胞成球能力较4T1细胞显著增强,MDA-MB-468-DOX细胞成球能力较MDA-MB-468细胞也显著增强(P <0.05);免疫荧光结果显示CD133在4T1-DOX细胞的表达比4T1细胞明显增高(P <0.05);流式细胞术结果表明CD44在4T1-DOX中表达较4T1细胞显著增高(P <0.05);Western blot结果显示Oct-4及p-Stat3在4T1-DOX细胞中的蛋白水平增高(P <0.05),而总Stat3的表达量未见显著改变。以上结果表明在0.1μmol/L多柔比星持续诱导下4T1细胞干性特征明显增强。加入Stat3抑制剂WP1066后,CD44、Oct-4和p-Stat3的蛋白水平均下降(P <0.05)。结论:多柔比星通过激活Stat3-Oct-4信号通路,使三阴性乳腺癌细胞成球能力增强,4T1细胞干性标志物CD133及CD44表达增多,诱导乳腺癌细胞干性的产生。因此,Stat3-Oct-4通路可能成为三阴性乳腺癌治疗的新靶标。

Exendin-4对胰岛素抵抗人肝癌HepG_2细胞脂代谢相关因子基因表达的影响

目的:探讨Exendin-4(Ex-4)对胰岛素抵抗(IR)人肝癌HepG2细胞脂代谢相关因子表达的影响,阐明Ex-4改善IR的作用。方法:选取处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞,采用高浓度胰岛素诱导HepG2细胞制备IR模型(HepG2-IR细胞),再将其分为对照组(不含胰岛素的HepG2细胞)、IR组(IR模型,即HepG2-IR细胞)和Ex-4组(IR模型中加入10nmol·L-1 Ex-4)。采用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)检测细胞中葡萄糖消耗量,采用油红O染色观察细胞形态及胞内脂滴形成情况,应用甘油三酯(TG)试剂盒检测细胞中TG水平,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)和载脂蛋白B100(apoB100)等脂代谢相关因子mRNA表达水平。结果:HepG2细胞建立IR模型后,与对照组比较,IR组HepG2-IR细胞葡萄糖消耗量明显降低(P<0.01);与IR组比较,Ex-4组HepG2-IR细胞葡萄糖消耗量明显增加(P<0.05)。油红O染色法,与对照组比较,IR组细胞含脂率明显升高(P<0.05);与IR组比较,Ex-4组细胞中含脂率明显降低(P<0.05)。与对照组比较,IR组细胞中TG水平明显升高(P<0.01);与IR组比较,Ex-4组细胞中TG水平明显降低(P<0.05)。qRT-PCR检测,与对照组比较,IR组细胞中ACC、FAS和SREBP-1cmRNA表达水平明显升高(P<0.01),apoB100mRNA表达水平明显降低(P<0.05);与IR组比较,Ex-4组细胞中ACC、FAS和SREBP-1cmRNA表达水平降低(P<0.05),apoB100mRNA表达水平升高(P<0.01)。结论:Ex-4可通过调节人肝癌HepG2细胞脂类代谢相关因子的表达进而改善IR。

SP13786通过CAFs外泌体抑制Stat3-EMT影响肺腺癌细胞A549的迁移侵袭

背景与目的成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是肿瘤相关成纤维细胞(cancerassociated fibroblasts,CAFs)的表面标志物之一,与CAFs的恶性表征关系密切,SP13786是FAP的特异性小分子抑制剂。本研究探讨SP13786作用于CAFs后,CAFs外泌体(exosomes,exo)对A549细胞迁移、侵袭的影响与机制。方法原代提取CAFs和癌旁成纤维细胞(peri-tumer fibroblasts,PTFs);MTT实验检测不同浓度SP13786对CAFs增殖的影响;聚合物沉淀法提取PTFs-exo、CAFs-exo以及CAFs+SP13786-exo。将A549细胞设对照组、PTFs组、CAFs组及CAFs+SP13786组并分别以等体积的DMEM、PTFs-exo、CAFs-exo及CAFs+SP13786-exo孵育细胞。激光共聚焦实验检测A549细胞摄取外泌体的情况;免疫荧光、免疫组化和Western blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、FAP在PTFs和CAFs中的表达及E-cadherin、N-cadherin、Slug、Stat3、P-Stat3在各组A549细胞中的表达;划痕实验和Transwell实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力。结果免疫荧光、免疫组化和Western blot结果均显示α-SMA、FAP在CAFs中高表达,在PTFs中低表达(P<0.05),表明从肺腺癌组织和癌旁组织中分别成功获得了CAFs和PTFs。MTT实验测得SP13786对于CAFs细胞的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)约为3.3 nmol/L。免疫组化和Western blot结果显示与CAFs组相比,CAFs+SP13786组的α-SMA与FAP的表达显著降低(P<0.05),说明抑制FAP可以显著降低CAFs的恶性表征。激光共聚焦结果显示外泌体能够被A549细胞所摄取。划痕实验与Transwell实验显示SP13786可抑制CAFs-exo对A549细胞迁移和侵袭的促进作用(P<0.05)。与CAFs组比较,SP13786组A549细胞E-cadherin表达增多,N-cadherin与Slug表达降低(P<0.05);免疫荧光与Western blot显示SP13786组A549细胞的P-Stat3较CAFs组明显降低(P<0.05),而总Stat3无显著差异。Stat3的特异性抑制剂WP1066明显抑制CAFs组A549细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),P-Stat3显著降低(P<0.05),而加入WP1066后再加入SP13786-exo,P-Stat3未见进一步减低,EMT的抑制亦未见显著变化(P>0.05)。结论FAP的小分子特异性抑制剂SP13786通过影响CAFs外泌体间接抑制A549细胞的迁移、侵袭,其可能机制是抑制Stat3的磷酸化从而影响A549细胞的EMT。

Gab2对人肺癌细胞A549侵袭能力影响及其机制的探讨

目的:探讨Grb2协同结合蛋白2(Grb2binding protein-2,Gab2)对人肺癌A549细胞体外迁移和侵袭的影响及其机制。方法:将质粒pGCsilencerU6/GFP/Neo-RNAi-Gab2#1、pGCsilencerU6/GFP/Neo-RNAi-Gab2#2和对照空载质粒转染到A549细胞中,建立Gab2低表达的siGab2/A549#1、siGab2/A549#2细胞和对照SCR/A549细胞。应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测小分子干扰RNA(siRNA)干扰Gab2表达后的基因和蛋白表达水平。趋化运动实验检测细胞的迁移能力;体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力;蛋白质印迹法检测siRNA干扰Gab2表达后,A549细胞在胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)刺激下基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metal-loproteinase-9,MMP-9)的表达及磷酸化Akt(pAkt)、磷酸化人雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamy-cin,pmTOR)的活化情况。结果:siRNA干扰Gab2表达后,RT-PCR测定A549细胞Gab2mRNA相对表达量为1.340±0.009,Scr/A549细胞为1.201±0.074,siGab2#1/A549细胞为0.315±0.008,siGab2#2/A549细胞为0.289±0.007。蛋白印迹法检测A549细胞Gab2蛋白表达量为0.205±0.003,Scr/A549细胞为0.241±0.004,siGab2#1/A549细胞为0.128±0.002,siGab2#2/A549细胞为0.066±0.001。siGab2#2/A549细胞与A549细胞比较Gab2基因表达显著降低,t=168.032,P<0.001;Gab2蛋白表达也显著降低,t=64.352,P<0.001。siGab2#2/A549细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于SCR/A549细胞,t值分别为5.101和10.812,P值分别为0.029和0.002。在IGF-1刺激下,siGab2/A549细胞的MMP-2、MMP-9蛋白的表达量不再有明显变化,t值分别为-2.051和-2.652,P值分别为0.054和0.064。siGab2/A549细胞中pAkt、pmTOR的活化也显著抑制。结论:Gab2可能通过调节Akt/mTOR信号通路,促进A549细胞的侵袭能力。

三羟异黄酮降低去卵巢大鼠外周血炎性因子和动脉张力

目的已有实验证实三羟异黄酮(GST)对绝经后妇女具有较好的心血管保护作用。观察GST对去卵巢大鼠外周血白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核转录因子κB(NF-κB)表达以及主动脉张力变化的影响,旨在探讨GST对绝经后女性心血管保护作用的机制。方法将40只成年雌性大鼠随机分成4组:假手术组(n=10),去卵巢组(n=10),雌激素组[20μg/(kg.d),n=10],GST组[200μg/(kg.d),n=10]。第8周末取标本,酶联免疫法测定大鼠血清IL-6、TNF-α和NF-κB水平。结果去卵巢组炎症标志物水平显著高于对照组[IL-6(95.8±16.2)比对照组(40.2±2.8)ng/L;TNF-α(60.3±6.4)比对照组(18.3±3.3)ng/L;NF-κB(11.9±3.3)比对照组(2.6±1.2)ng/L,均P<0.01]。补充GST后IL-6(43.4±3.7)ng/L、TNF-α(19.9±3.2)ng/L和NF-κB(2.2±1.0)ng/L水平均显著降低(均P<0.01)。去卵巢大鼠主动脉张力[最大收缩力(4.58±1.36)g]明显高于对照组[最大收缩力(1.83±0.95)g,P<0.01)],补充GST可明显降低动脉血管张力[最大收缩力(1.99±0.39)g,P<0.01]。结论GST能显著降低去卵巢大鼠外周血中IL-6、TNF-α和NF-κB水平和主动脉张力。

慢性荨麻疹患者血浆RANTES、嗜酸粒细胞趋化因子、TNF—α与白三烯B4水平的测定

目的探讨慢性荨麻疹患者血浆中调节激活正常T细胞表达和分泌的细胞因子（RANTES）、嗜酸粒细胞趋化因子（eotaxin）、TNF—α及白三烯B4（LTB4）的水平及其意义。方法对41例慢性荨麻疹患者进行临床评价，按症状积分将病情分为轻型、中型、重型3级。应用咪唑斯汀10mg每日1次，连续治疗4周。采用ELISA法测定20例健康志愿者与41例患者治疗前后血浆中RANTES、eotaxin、TNF-α与LTB4的水平。结果①慢性荨麻疹组血浆中RANTES、eotaxin、TNF-α和LTB4水平分别为（52．5±10．2）μg／L、（58．4±16．1）μg/L、（35．1±9．6）ng／L和（109．4±21．7）ng／L，健康对照组水平分别为（33．7±9．4）μg／L、（48．3±13．6）μg／L、（21．3±8．9）ng／L和（77．8±11．6）ng／L，两组比较差异均有统计学意义，P值分别〈0．01、〈0．05、〈0．01、〈0．01。②血浆RANTES、eotaxin、TNF-α、LTB4水平与临床表现的相关性分析显示：中、重型慢性荨麻疹患者的RANTES、eotaxin、TNF-α与LTB4血浆水平高于轻型患者，差别均有统计学意义，P〈0．05；重型患者的RANTES、eotaxin、TNF-α与LTB4血浆水平较中型患者略有增高，但差异均无统计学意义，P〉0．05。③咪唑斯汀治疗后慢性荨麻疹组血浆中RANTES、eotaxin、TNF—α和LTB4水平较前明显下降，分别为（36．3±8．9）μg／L、（46．3±10．2）μg／L、（23．2±7．5）μg／L和（83．1±14．2）ng／L，与治疗前比较差异有统计学意义，P值均〈0．01，与健康对照组比较P值均〉0．05。结论慢性荨麻疹患者血浆RANTES、eotaxin、TNF-α与LTB4水平升高，并与病情的严重程度呈正相关趋势，咪唑斯汀治疗后血浆中RANTES、eotaxin、TNF—α和LTB4水平较前明显下降，提示RANTES、eotaxin、TNF-α与LTB4在慢性荨麻疹的发病过程中可能起一定作用。

二十二碳六烯酸-磷脂对AD大鼠学习记忆的影响

目的研究二十二碳六烯酸-磷脂（docosahexaenoic acid-phosphatidylcholine,DHA-PC）对海马CA1区注射Aβ25-35所致的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）大鼠模型学习记忆能力改善作用,为DHA-PC的药用开发奠定理论基础。方法 SPF级雄性Wistar大鼠40只,250～300g,随机分为正常对照组、AD组、多奈哌齐组、DHA-PC组。大鼠双侧海马CA1区注射Aβ25-35制作AD大鼠模型,水迷宫检测学习记忆能力改变,检测Tau（Ser 396）蛋白的含量,检测超氧化物歧化酶活性。结果水迷宫结果显示：与AD组相比,定向航行实验DHA-PC组大鼠的潜伏期明显降低（P〈0.05）;空间探索实验DHA-PC组大鼠在安全平台所在象限的活动时间明显增加（P〈0.05）。与AD组相比,DHA-PC组和DHCI组大鼠皮层和海马的Tau（Ser396）蛋白含量明显降低（P〈0.05,P〈0.01）,DHA-PC组和DHCI组皮层SOD活性增强（P〈0.01）。结论 DHA-PC可通过降低皮层和海马396位点磷酸化Tau蛋白的表达和增强SOD活性,改善AD大鼠学习记忆能力,具有较好的药用开发前景。