组织因子在下肢深静脉血栓动物模型中的表达变化及其作用机制

目的构建大鼠下肢深静脉血栓(DVT)模型,探讨组织因子(TF)表达及作用机制。方法构建TF小干扰RNA(siRNA)特异性沉默TF表达,转染大鼠成纤维细胞RFL-6,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)实验检测转染效率。通过大鼠尾静脉注射进行动物预处理及分组,72只雄性6~8周龄无特定病原体(SPF)级SD大鼠采用随机数字表法随机分为空白对照组(6只)、假手术组(6只)、模型组(30只)、抑制组(30只),空白对照组不进行任何处理,假手术组仅进行开腹手术,不结扎静脉,模型组行开腹手术结扎静脉构建DVT模型,抑制组在模型组基础上行TF siRNA预处理。分别于术后2、8、24、48、72 h处死大鼠,取血清样本,RT-PCR实验检测不同组别大鼠血样中TF、组织因子途径抑制物(TFPI)、P选择素(P-selection)及P选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)mRNA表达水平;酶联免疫吸附试验检测大鼠血清TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达水平,多组数据间比较采用单因素方差分析,两组数据间均数比较采用SNK-q检验;Spearman检验分析TF与各生物学指标在血栓形成中的关系。结果模型组大鼠术后静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平明显高于空白对照组和假手术组大鼠[TF,1.54±0.12、1.02±0.03、1.03±0.02(t=11.322,P<0.05);TFPI,1.47±0.21、1.04±0.03、1.03±0.04(t=9.382,P<0.05);P-selection,1.59±0.12、0.95±0.05、1.03±0.03(t=12.720,P<0.05);PSGL-1,1.47±0.14、0.96±0.03、1.08±0.04(t=10.243,P<0.05)],差异均有统计学意义,模型组大鼠术后静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量均于空白对照组和假手术组大鼠[TF,(102.42±8.42)、(56.32±5.64)、(52.43±6.32)ng/L(t=14.230,P<0.05);TFPI,(42.43±4.45)、(36.43±3.42)、(38.43±4.10)μg/L(t=10.188,P<0.05);P-selection,(34.32±4.43)、(21.32±3.24)、(23.43±3.20)μg/L(t=9.272,P<0.05);PSGL-1,(1432.43±110.42)、(832.43±32.43)、(845.43±43.84)μg/L(t=10.054,P<0.05)],差异均有统计学意义,且模型组大鼠术后2、8、24 h时静血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平明显高于空白对照组和假手术组大鼠[TF,1.54±0.12(t=7.282,P<0.05),1.61±0.21(t=6.640,P<0.05),1.97±0.22(t=8.022,P<0.05);TFPI,1.47±0.21(t=11.022,P<0.05),1.50±0.18(t=12.103,P<0.05),0.52±0.20(t=11.039,P<0.05);P-selection,1.59±0.12(t=11.651,P<0.05),1.68±0.20(t=9.022,P<0.05),2.23±0.31(t=7.292,P<0.05);PSGL-1,1.47±0.14(t=8.023,P<0.05),1.60±0.23(t=7.026,P<0.05),2.20±0.34(t=8.554,P<0.05)],模型组大鼠术后2、8、24 h时静血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量也明显高于空白对照组和假手术组大鼠[TF,(102.42±8.42)ng/L(t=7.166,P<0.05),(135.43±8.53)ng/L(t=9.025,P<0.05),(158.76±22.32)ng/L(t=12.305,P<0.05);TFPI,(42.43±4.45)μg/L(t=15.021,P<0.05),(51.42±5.43)μg/L(t=11.353,P<0.05),(68.64±6.87)μg/L(t=13.004,P<0.05);P-selection,(34.32±4.43)μg/L(t=8.023,P<0.05),(42.43±5.11)μg/L(t=12.020,P<0.05),(59.56±8.31)μg/L(t=10.266,P<0.05);PSGL-1,(1432.43±110.42)μg/L(t=8.102,P<0.05),(1544.32±96.43)μg/L(t=10.442,P<0.05),(1703.42±117.46)μg/L(t=9.225,P<0.05)],差异均有统计学意义,至术后24 h时达最高水平。模型组大鼠术后48 h及72 h静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平出现降低趋势。抑制组大鼠术后2、8、24、48、72 h时静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平明显低于空白对照组及假手术组[TF,0.43±0.01、0.53±0.01、0.59±0.02、0.61±0.03、0.62±0.01、2.02±0.22、2.02±0.24(t=14.385,P<0.05);TFPI,0.45±0.02、0.50±0.02、0.58±0.02、0.60±0.02、0.61±0.03、0.51±0.18、0.50±0.20(t=13.022,P<0.05);P-selection,0.34±0.03、0.55±0.03、0.67±0.04、0.60±0.02、0.55±0.03、2.02±0.16、1.79±0.14(t=15.335,P<0.05);PSGL-1,0.40±0.02、0.54±0.02、0.71±0.04、0.62±0.03、0.57±0.03、1.84±0.16、1.65±0.15(t=10.283,P<0.05)],差异均有统计学意义,抑制组大鼠术后2、8、24、48、72 h时静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量明显低于空白对照组及假手术组[TF,(34.64±5.64)、(50.53±10.54)、(65.43±11.42)、(48.42±12.42)、(38.42±10.24)、(102.32±7.43)、(93.43±6.48)ng/L(t=12.473,P<0.05);TFPI,(21.42±9.40)、(29.42±6.75)、(37.53±5.48)、(32.43±10.48)、(24.54±6.63)、(57.65±6.40)、(53.23±4.30)μg/L(t=11.255,P<0.05);P-selection,(13.42±2.23)、(15.54±3.02)、(18.76±2.43)、(15.43±1.43)、(11.43±2.03)、(43.43±5.03)、(37.65±5.11)μg/L(t=12.336,P<0.05);PSGL-1,(588.54±98.53)、(645.32±103.42)、(785.54±120.32)、(677.76±124.43)、(544.65±109.43)、(1343.53±75.43)、(1197.32±89.32)μg/L(t=8.102,P<0.05)],差异均有统计学意义,抑制组大鼠术后2、8、24 h时各观察指标呈增长趋势,至术后24 h时达最高水平,但静脉血中P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平和TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量均呈现降低表现。相关性分析结果显示,DVT模型中,大鼠静脉血中TF表达水平与TFPI(r=0.632,P<0.05)、P-selection(r=0.513,P<0.05)、PSGL-1(r=0.651,P<0.05)呈明显正相关。结论大鼠DVT模型静脉血中,TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量与血栓形成进程有关,TF表达与TFPI、P-selection、PSGL-1表达存在正相关,P-selection、PSGL-1可通过介导内皮细胞黏附影响TF表达,调节血栓形成。