山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定

为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类,从山东诸地11个蔬菜种植区采集了867个葫芦科蔬菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样品分别进行RT-PCR检测,各病毒检出率分别为34.8%,10.4%,20.0%,41.7%,27.0%,7.8%,2.6%,1.7%,0,0.9%。表明除PNRSV外,其他9种病毒在山东各地均有发生,且CMV和TMV发病率较高,2种或2种以上病毒复合侵染也很普遍。同时为明确山东地区CMV分离物的株系分化状况,选取11个地区有代表性的CMV阳性样品,测定其外壳蛋白(Coat protein,CP)和RNA3核苷酸序列并进行序列比对和进化分析,结果显示侵染山东地区葫芦科蔬菜的CMV分离物均属于IB亚组,与韩国分离物As(AF013291)相似性最高,未发现其他株系。

葱细胞质雄性不育与花蕾发育过程中活性氧代谢关系研究

以葱细胞质雄性不育系CA及其同核异质保持系CB为材料,通过分析花蕾发育过程中活性氧(O2)产生速率、丙二醛(MDA)含量以及抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶)活性变化研究了活性氧产生与清除的动态变化。结果表明:不育系花蕾败育初期,活性氧产生速率持续增加至败育盛期达最高值,而丙二醛含量变化则从中蕾期开始大量积累至败育盛期接近最高值,表现一定的滞后性。两系比较,从小蕾期开始不育系活性氧产生速率和丙二醛含量显著高于保持系。受活性氧产生的诱导作用,败育始期超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性均呈增加趋势,但在败育盛期SOD、CAT活性明显下降,显著低于保持系。而POD活性则在中蕾期前低于保持系,之后显著高于保持系,造成雄性器官发育过程中IAA的亏缺。因此,葱花蕾发育过程中O2代谢失调和MDA过量积累以及保护酶活性下降或功能转变可能是导致雄性不育的重要因素。

基于PCR技术快速制备DNA Marker的研究

DNA Marker是一组分子量大小已知的DNA片段混合物,用于指示核酸电泳中未知样品的分子量大小。基于PCR方法,设计了不同的引物对,以质粒p32a-CP为模板,分别扩增出大小为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp的DNA片段,初次制备出DNA Marker,并参照商品化的DM2000按一定的比例混合各片段进行优化。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,所制备的DNA Marker(命名为DL2000)质量稳定、条带清晰、分布均匀,在分子生物学试验中可用于标记DNA大小。

侵染番茄的番茄褪绿病毒山东泰安分离物的分子鉴定和序列分析

2012年秋季,在山东泰安番茄主要种植区中采集到叶片褪绿,叶脉颜色变深的疑似番茄褪绿病毒病和番茄侵染性褪绿病毒病的番茄样品。利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)的特异引物ToCV1/ToCV2和番茄侵染性褪绿病毒(Tomato infectious chlorosis virus,TICV)的特异引物TICV1/TICV2分别对样品进行扩增,最后仅得到利用引物ToCV1/ToCV2扩增的101bp的核苷酸序列,对该核苷酸序列克隆并测序。序列比对表明,山东泰安地区分离物与已登录的番茄褪绿病毒(ToCV)分离物相似性都在99%以上。随后,对山东泰安种植区ToCV番茄分离物进行外壳蛋白(CP)及热激蛋白(HSP70)序列的扩增、克隆和测序(GenBank登录号KC812620/KC812625),经NCBI BLAST比对发现,目的序列与番茄褪绿病毒日本番茄分离物ToCV-Japan/Tochigi(GenBank登录号AB513442/AB513443)相似性最高为99%,同属于毛型病毒属的番茄褪绿病毒,这是首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染。

北方四省区番茄褪绿病毒的分子鉴定

2015-2016年间,在山西省、内蒙古自治区、辽宁省、吉林省采集到疑似感染番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)的番茄植株。利用扩增ToCV外壳蛋白(coat protein,CP)和类热激蛋白(heat shock protein 70homolog,HSP70h)基因片段的两对特异性引物,通过RT-PCR对疑似样品进行分子检测,得到970bp和1 864bp的特异条带,经测序、比对确定为ToCV。序列分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853540)的CP核苷酸序列与河南安阳分离物HNAYHX(KP264983)相似性为99.7%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204709)和辽宁大连分离物LNDL(KU204707)的CP核苷酸序列与国内已报道的山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.5%和99.7%,吉林长春分离物JLCC(KU306111)的CP核苷酸序列与山东聊城分离物SDLC(KC812622)的相似性为99.8%。而HSP70h核苷酸序列的相似性分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853539)与日本分离物Tochigi(AB513442)相似性为99.4%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204710)、辽宁大连分离物LNDL(KU204708)和吉林长春分离物JLCC(KX880384)与山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.7%、99.8%和99.7%。试验结果明确了番茄褪绿病毒已蔓延传播到我国山西、内蒙古及东北地区。

番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

2013年秋季,在山东寿光设施番茄植株上采集到叶片脉间褪绿黄化、叶片边缘卷曲、叶片皱缩,后期叶片变厚、变脆,并伴随着植株矮化的疑似番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的样本。分别利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)外壳蛋白基因(CP)序列引物CP-F/CP-R和番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)特异引物TY1-R/TY1-F、TY2-R/TY2-F、TY3-R/TY3-F对其进行检测、扩增,分别得到774bp(Gen Bank登录号KC709510)和2781bp(Gen Bank登录号KJ546418)的核苷酸序列。经序列测序后表明,KC709510与Gen Bank已登录的番茄褪绿病毒To CV-BJ(KC311375)分离物相似性为99.6%,KJ546418与Gen Bank已登录的番茄黄化曲叶病毒TYLCV-SDWF-L7(KC999850)分离物相似性为99.6%。

番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

以纯化的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)外壳蛋白为抗原,免疫家兔制备并纯化出TYLCV的多克隆抗体IgG,以此抗体做包被抗体,并用碱性磷酸酶(AP)对其进行标记作为酶标抗体,从而建立了番茄黄化曲叶病毒的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法。通过ELISA方阵试验确定该法的最佳工作浓度为酶标抗体(IgG-AP)作1∶400倍稀释,包被抗体浓度为6.25μg.mL-1;并且确定了抗原最低检出浓度为9.75ng.mL-1。采用该法对山东寿光的田间病样进行了定性和定量检测,结果表明建立的DAS-ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于番茄黄化曲叶病毒的常规检测。

应用TDZ优化生菜再生体系的建立

以生菜（Lactuca sativa L.）栽培品种香港玻璃生菜为试验材料建立了高频再生快繁体系,研究了不同消毒方式对种子消毒效果及无菌苗生长的影响,探讨了不同激素水平和培养基对子叶愈伤组织诱导、再分化及诱导生根的关系。结果如下：种子在70%酒精处理60 s,2%Na Cl O消毒10 min后,播种到MS培养基上种子发芽率最高,达98%,且无菌苗生长好;外植体宜选生长3~5 d的生菜无菌苗子叶,适宜不定芽分化的最优条件组合为MS＋0.1 mg·L-1TDZ＋0.1 mg·L-1NAA,不定芽分化率高达83.3%,分化指数为7.7,MS＋0.3 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA适宜其继代扩繁培养;NAA和IAA复合使用有利于生根,最适生根培养基为1/2MS＋0.05 mg·L-1NAA＋0.5 mg·L-1IAA。

补血草种子萌发对温度、NaCl胁迫的响应

以补血草种子为试验材料,研究不同温度及NaCl胁迫(0~12 g/L)对其种子萌发的影响,对其发芽率、发芽指数、相对盐害率及胚芽、胚根生长情况等进行测定,并进行了复萌试验。研究结果表明,温度过低或过高均抑制补血草种子萌发,延缓其萌发时间,补血草种子萌发的最适温度为20~25℃;补血草种子的发芽率、发芽指数与NaCl的浓度呈负相关,相对盐害率则正好相反;随着NaCl浓度的增大,补血草胚芽和胚根生长受到的抑制逐渐增大,且胚根的受抑制作用较大;复萌试验结果表明,补血草种子在NaCl溶液中具有活力,胁迫解除后仍能迅速萌发,总萌发率均在50%以上。

山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用双生病毒简并引物PA/PB,对山东寿光地区保护地疑似感染番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的番茄植株进行PCR检测,结果证明番茄病叶由TYLCV侵染所致。以提取的病叶总DNA为模板,扩增得到长约770bp的TYLCV-CP基因片段,克隆至pEASY-T1Simple载体,然后用XhoI和EcoRI将其切下并插入到pET-32a表达载体中,构建了寿光地区TYLCV分离物的外壳蛋白基因原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导获得了50kD重组蛋白,Ni2+-NTA亲和层析纯化和Western印迹分析证明目的蛋白为TYLCV外壳蛋白,且具有良好的抗原活性。

番茄褪绿病毒RT-PCR检测技术的优化及河南分离物的鉴定

为获得高效、灵敏和稳定的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)RT-PCR检测体系,选取文献报道的和重新设计的共9套ToCV的RT-PCR引物,经过一系列测试和比较,筛选出了灵敏度、特异性均较高的引物组合,并对反应条件、参数进行了优化,确定了最优反应条件。应用优化的ToCV RT-PCR检测体系对从河南设施蔬菜生产区采集的疑似感病番茄样品进行检测,扩增产物测序后经BLAST比对发现,河南分离物的CP和HSP70基因序列与GenBank上注册的ToCV典型分离物序列的相似性均达94%以上,通过对ToCV病毒粒子的电镜观察而进一步确定ToCV已在河南侵染设施番茄。

耐盐碱刺槐离体再生快繁体系的建立与优化

为提高耐盐碱刺槐的快繁效率,满足沿海及滨海盐碱地区绿化要求,以耐盐碱刺槐无性系"W009"和"W038"为试材,研究不同条件对耐盐碱刺槐试管苗分化和生根的影响.结果表明:两刺槐茎尖初代接种不定芽萌发率均好于茎段,"W009"离体茎尖不定芽萌发的最适培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L^(-1)+NAA 0.05mg·L^(-1),茎段不定芽萌发的最适培养基为MS+6-BA 1.0mg·L^(-1)+NAA 0.1mg·L^(-1);而适合"W038"离体茎尖和茎段不定芽萌发的最适培养基则为MS+6-BA 1.0mg·L^(-1)+NAA 0.1 mg·L^(-1);适合"W009"不定芽增殖的培养基为MS+6-BA 1.0mg·L^(-1)+NAA 0.05mg·L^(-1),"W038"不定芽增殖的培养基为MS+6-BA 2.0mg·L^(-1)+NAA 0.1 mg·L^(-1);"W009"最适生根培养基为:1/2 MS+0.1 mg·L^(-1) IBA+0.2mg·L^(-1) NAA+1.0g·L^(-1)活性炭;"W038"最适生根培养基为:1/2 MS+0.3 mg·L^(-1) IBA+0.2 mg·L^(-1) NAA+1.0g·L^(-1)活性炭.

番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。

光质对生姜试管苗生长及微型姜诱导的影响

采用裂区试验设计方法,研究了光质对不同品种生姜试管苗生长及其对试管微型姜形成的影响。结果表明,蓝光(B)处理的试管苗繁殖系数较白光(W)处理增加18.97%,绿光(G)处理则降低15.31%,红光(R)、黄光(Y)处理与W处理无显著差异,试管苗单株生物量除G处理与W处理无显著差异外,R、B、Y处理分别较W处理降低14.16%、22.70%、34.61%,且G、R处理的试管苗株高较W处理显著增加,G、Y、R处理的茎粗则显著降低。G、B、R处理试管苗微型姜形成时间分别较W处理提早19.76%、17.44%、10.12%,而Y处理则延迟了11.86%;微型姜鲜质量以G处理较高,达2.23 g,较W处理增加34.34%,而R、B、Y处理则与W处理无显著差异。不同品种生姜试管苗生长量及微型姜形成也显著不同,其繁殖系数以莱芜小姜(LWXJ)处理较高,莱芜大姜(LWDJ)处理次之,山农大姜(SNDJ)处理较低,单株生物量则相反,分别为3.49、3.82、4.10 g;LWXJ、LWDJ、SNDJ处理微型姜形成所需时间分别为39.05、37.18、34.51 d,其微型姜鲜质量分别为1.35、1.52、2.60 g。

蔷薇新品种‘鲁硕红’的选育

我国是蔷薇属植物的主要发源地之一，具有丰富的蔷薇种质资源。但我国蔷薇资源的开发利用还很不充分，尽管现代蔷薇的品种丰富，但在抗病性、芳香性等方面仍有不足，急需引入更优良的蔷薇种质资源，并充分利用蔷薇属植物种质资源的遗传多样性，深入开展蔷薇属植物的资源收集、良种筛选和选育工作。为此，我们于2002年从荷兰引进了一批蔷薇天然杂交种，对其进行播种、试种、选育，从中选出优良品种‘鲁硕红’蔷薇，该品种于2011年12月通过了山东省林木品种审定委员会的审定。1

番茄新品系潍科红3号的选育

番茄新品系潍科红3号是以自交系KT007C为母本、JH005D为父本配制而成的一代杂交种。该组合综合性状表现突出，连续坐果性好，单果重240～260g，果实硬度高达3．6kg／cm^2。耐贮运，果实大小整齐一致，畸形果及裂果率极低，果面光滑，对温度适应能力强，抗番茄黄化曲叶病毒。2014年1月通过山东省科技计划项目验收鉴定，适于温室和大棚早春、秋延迟及越冬栽培，现已连续两年在山东省多地推广种植．累计推广面积达1733hm^2。

蔷薇良种‘鲁硕红’

‘鲁硕红’是从荷兰引进的天然杂交种子中选育出的优良品种,其花型特大,花直径8～10cm,开花早,花期长,花色鲜艳,花量繁多,单枝顶梢簇生多达87朵,香味清雅;适应性强、稳定性好,耐干旱、寒冷、瘠薄等逆境条件,抗病性好,对白粉病免疫,在山东各地均适宜种植。

“复瓣玫瑰红”组织培养快繁体系的建立

以“复瓣玫瑰红”茎段为外植体，进行腋芽取材时期、腋芽节径、培养基中无机盐离子浓度、不同激素配比和组培苗驯化移栽试验。结果表明：“复瓣玫瑰红”蔷薇取材的最佳时期是5月和11月，所取材料是当年生枝条的中间部分，采用1／2MS为基本培养基并添加0．1mg／LNAA＋1．0mg／L6-BA的激素组合腋芽萌发效果最好，其萌发率最高可达100％；腋芽分化的最佳培养基为：1／2MS＋0．2mg／LNAA＋2．0mg／L6．BA，增殖系数达到8-3；最佳生根培养基为1／2MS＋0．1mg／LNAA＋0．2mg／L6-BA组合，生根率可达97．1％；组培苗移栽时，以纯蛭石为基质，先将生根瓶苗移至炼苗室进行9～13d的移栽前锻炼，并保持雾状喷水，移栽成活率可达80．0％。

光质对试管生姜生长发育及微型姜形成、品质的影响

为提高生姜微繁效率,研究了不同光质对生姜试管苗生长和微型姜形成及品质的影响。结果表明,与白光处理相比,绿光、红光均显著增加了生姜试管苗的株高,绿光显著降低了其繁殖系数,而蓝光则增加了其繁殖系数;黄光对试管苗生长的影响较小。生姜试管苗叶片净光合速率以绿光处理较低,蓝光和红光较高,但叶片气孔导度及蒸腾速率则以蓝光、黄光处理较高,红光、绿光处理较低。绿光、蓝光、红光均可诱导试管苗较早形成微型姜,而黄光则延迟了微型姜的形成;微型姜鲜重以绿光处理较高,较白光处理增加60%以上;但微型姜干物质、淀粉、粗纤维含量均以绿光处理较低,蓝光处理较高;可溶性糖含量以红光、黄光处理较高,绿光、蓝光处理较低,而可溶性蛋白含量基本呈相反的趋势。综合考虑,绿光有利于微型姜鲜重的增加,但蓝光更有利于提高组培快繁效率及微型姜的大量获得。

苗期紫外线B照射对丝瓜叶片生长和生理活性的影响

以‘维科1号’丝瓜为试材,研究了不同紫外线B(UV-B)处理对苗期丝瓜生长和生理活性的影响。结果表明:适量的UV-B照射可以起到促进丝瓜植株生长,提高水分利用效率的作用;持续的UV-B照射会抑制丝瓜植株生长,降低丝瓜叶片的净光合速率、气孔导度,加重PSII光抑制,同时可以提高叶片水分利用效率和叶片抗氧化酶活性;而只在苗期进行10d的UV-B照射,可以明显促进植株生长,提高成苗的叶片净光合速率,但同时降低气孔导度,从而大幅提高叶片的光合水分利用效率,同时苗期UV-B处理明显增加了成苗叶片抗氧化酶活性,从而提高成苗叶片的光抑制抗性;试验表明苗期适量的UV-B照射是促进丝瓜植株生长,同时减少水分消耗的经济、有效的方法。