雪旺细胞促进组织工程骨修复大鼠股骨缺损的实验研究

目的探讨雪旺细胞（SCs）对β-磷酸三钙／骨髓基质干细胞诱导分化的成骨细胞（β-TCP／BOOB）组织工程骨修复大鼠股骨缺损的影响。方法将SD大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）诱导分化为BDOB，并从SD乳鼠中提取SC8。将36只SD大鼠随机分为3组。每组12只，分别将术前预种植SC8的β-TCP／BOOB组织工程骨（A组）、β-TCP／BDOB组织工程骨（B组）、单纯β-TCP材料（C组）植入大鼠体内内修复长度为8mm的股骨缺损。于术后12周行x线摄片、组织学检查和显微CT扫描观察各组股骨缺部位化新生骨质的形成情况.结果术后12周x线片和显微CT扫描结果显示：A组大鼠骨缺．}!，!tZ完企愈合，B组1人鼠股骨缺拟部分愈合，c组大鼠股骨缺损术愈合。A组、B组、c组的x线影像。#坪分甲均分别为（12．08±0．90）、（9．25±1．06）、（6．17±1．12）分，3组比较差异有统计学意义（F=99．553、P=0．000），3组间两两比较差异均有统计学意义（P〈0．05）、组织学检查结果显示：A组植入物有大量骨质形成，广泛分布肥大的软骨细胞与成骨细胞；B组植入物中也可见散在新生骨形成，软骨细胞与成骨细胞散在稀疏分市；C组机人物中新生骨质形成极少，几乎未见软骨细胞或成骨细胞．结论SCs可提高B—TCP／BDOB组织工程骨修复大鼠股骨缺拟的效果。

增强型生物活性玻璃/胶原复合材料的促血管化作用

目的骨组织工程所使用的支架材料能否快速、有效地血管化是骨修复的关键。研究增强型生物活性玻璃/胶原复合材料对血管化的协同和促进作用,为构建血管化组织工程骨修复骨缺损寻找适宜的支架材料。方法体外分离获取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并通过血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)与CD34抗原鉴定,取第1代细胞用于实验。将细胞接种于增强型生物活性玻璃/胶原复合材料上,扫描电镜观察细胞黏附情况。取细胞接种于增强型生物活性玻璃/胶原复合材料作为实验组,等量细胞直接接种于培养板常规培养作为对照组,采用alarmarBlue法动态检测细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测内皮细胞相关基因VEGF、血管内皮生长因子受体1(fms-related tyrosine kinase1,Flt-1)、血管内皮生长因子受体2(kinase insert domain receptor,Kdr)的mRNA表达。取SD大鼠6只,将支架材料包埋于大鼠股内侧皮下,实验组采用增强型生物活性玻璃/胶原复合材料、中央轴向植入血管束,对照组采用非增强型生物活性玻璃/胶原复合材料,分别于植入5、10d取出,行冰冻切片并HE染色动态观察支架材料内部的血管化状态。结果分离的细胞通过形态学及vWF、CD34免疫荧光鉴定为HU VECs。扫描电镜示HUVECs在支架材料上黏附较好。HUVECs在实验组支架材料上增殖明显,在第3天后细胞增殖率开始高于对照组,11d达到增殖平台期时细胞数仍多于对照组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,培养3d实验组VEGF、Flt-1、Kdr的mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05)。包埋大鼠皮下实验可见,实验组5、10d时植入的血管仍通畅,其周围新生血管随时间延长而增多,材料周缘可见宿主血管浸润生长,但新生血管稀疏;对照组仅有纤维组织生长,10d时材料已大部分降解,组织难以长入。结论增强型生物活性玻璃/胶原复合材料在大鼠体内外可促进血管化,可能适于作为构建血管化组织工程骨的支架材料。

灌注培养对骨髓基质干细胞在大段材料上增殖与分布的影响

目的 探讨灌注培养对骨髓基质干细胞（BMSCs）在大段材料上增殖与分布的影响。方法在大段多孔磷酸三钙材料上种植转染了增强型绿色荧光蛋白基因的大鼠BMSCs（eGFP—BMSCs），分别采用灌注式生物反应器（实验组）和静止培养法（对照组）进行培养。培养7、28d行扫描电镜观察；培养7、14d行荧光显微镜观察；动态监测葡萄糖Ft耗量；培养7、14、28d测定支架上各层细胞的数量，观察eGFP—BMSCs在支架上的增殖与分布情况。结果 扫描电镜和荧光显微镜下观察发现各时间点实验组eGFP—BMSCs均可在支架边缘和内部分布与增殖，而对照组细胞仅能在支架边缘分布与增殖。两组葡萄糖日耗量均随着培养时间的延长而增加，培养28d时实验组葡萄糖日耗量【（36．33±3．14）mg／d】是对照组【（9．82±1．33）mg／d]的3．7倍，两组分别于20、15d进入平台期。实验组培养7、28d时支架各层细胞数量差异无统计学意义（P〉0．05），14d时各层细胞数量的差异有统计学意义（P〈0．05）；而对照组各时间点支架各层细胞的数量差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论灌注培养法能促进BMSCs在大段多孔材料上增殖，并能使其在大段材料上均匀分布。

增强型生物活性玻璃一胶原复合支架材料的成骨效能研究

目的 探讨增强型生物活性玻璃一胶原复合支架材料的体内外成骨效能。方法取第3代BMSCs种植于支架材料（支架组），以等量细胞常规培养作为非支架组，培养1、3、5、7、9、11d采用阿尔玛蓝法动态检测细胞的增殖率。取第3代BMSCs种植于支架材料（体外实验组），以等量细胞常规培养作为体外对照组，培养4、7d采用实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT—PCR）检测细胞骨形态发生蛋白一2（BMP一2）、碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原的mRNA表达。裸鼠皮下植入复合成骨样细胞的支架材料（体内实验组），取正常骨组织作为体内对照组，6周后以X线片、qRT—PCR、组织学染色评估成骨情况。结果培养7～11d支架组细胞增殖率显著高于非支架组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。体外实验组培养7dBMP一2、ALP、I型胶原的mRNA表达显著高于体外对照组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。体内实验组x线片示植入区域有密度增高影，支架材料形成白色硬性组织；BMP一2、I型胶原、骨钙素、骨桥蛋白的mRNA表达较体内对照组均增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；组织学染色示支架材料大部分降解，新生骨形成明显。结论增强型生物活性玻璃一胶原复合支架材料具有良好的生物相容性．体内外均具有成骨效应。