利用废弃胚胎进行体外受精实验室质控的可行性探讨

目的探讨废弃胚胎作为体外受精(IVF)实验室质控的可行性。方法通过囊胚序贯培养将无原核(0PN)、单原核(1PN)、3原核(3PN)和发育迟缓或停滞的2原核(2PN)的废弃胚胎进行囊胚培养,比较不同来源胚胎的囊胚形成情况。结果共收集396个废弃胚胎,经序贯培养形成98个囊胚(24.75%),0PN、2PN、1PN、3PN的囊胚形成率分别为50.50%(51/101)、24.59%(30/122)、1 7.07%(7/41)、7.58%(10/132),其中0PN、停滞的2PN的胚胎有孵出,孵出率分别为47.06%(24/51)和33.33%(10/30);有囊胚形成与无囊胚形成患者的临床妊娠率分别为30.28%(43/142)、1 9.72%(28/142),两者相比有统计学差异(P<0.05);特别是0PN+2PN患者的临床妊娠率为23.24%(33/142),显著高于无囊胚形成者的9.15%(13/142)(P<0.01)。结论废弃胚胎有不同程度的发育潜能,可部分发育成囊胚,特别是0PN+2PN囊胚形成率超过35%,可以作为IVF实验室质控的一种辅助方法,并可作为临床妊娠结局预测的参考指标。

人胎盘间充质干细胞治疗小鼠变应性鼻炎的有效性研究

目的探讨人胎盘间充质干细胞(human placenta derived mesenchymal stem cells,HP-MSCs)对变应性鼻炎(AR)小鼠的治疗效果。方法将32只BALB/c小鼠随机平均分为4组(表示为:致敏/激发/治疗):对照组(PBS/PBS/PBS),对照+HP-MSCs组(PBS/PBS/HP-MSCs),AR+PBS组(OVA/OVA/PBS),AR+HP-MSCs组(OVA/OVA/HP-MSCs)。建立卵清蛋白(OVA)联合氢氧化铝诱导的小鼠AR模型,在造模的第20天尾静脉注射0.2 ml PBS或HP-MSCs。评估各组小鼠AR鼻部症状变化;血涂片瑞氏染色观察外周血中嗜酸性粒细胞比例;酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定外周血Ig E、Ig G1水平及鼻黏膜白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-13水平。结果AR+HP-MSCs治疗组AR组小鼠AR行为症状学评分显著减轻(6.25±0.89vs.3.38±0.74,P<0.001);外周血嗜酸性粒细胞比例明显降低[(1.63±1.03)%vs.(4.13±2.57)%,P<0.05];外周血Ig E、Ig G1水平明显降低[(36.89±2.34)ng/ml vs.(57.23±2.81)ng/ml,(21.35±0.80)ng/ml vs.(27.23±0.55)ng/ml,P均<0.05];鼻黏膜IL-4、IL-5、IL-13水平降低[(229.64±12.23)pg/mlvs.(364.17±18.81)pg/ml;(48.70±3.87)pg/mlvs.(68.36±6.88)pg/ml;(41.27±2.48)pg/ml vs.(60.60±4.75)pg/ml,P均<0.05]。结论静脉注射HP-MSCs可以有效治疗小鼠AR,为进一步治疗人AR提供新思路与理论基础。

半乳糖凝集素3对内皮细胞生长、迁移及炎症反应的影响

目的:探讨半乳糖凝集素3(GAL-3)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)生长、迁移及炎症反应的影响及其作用机制。方法:体外培养HUVECs,给予GAL-3重组蛋白2 mg/L或GAL-3短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体处理,实验分为正常对照组、GAL-3重组蛋白处理组、阴性对照组和GAL-3-shRNA组。通过实时荧光定量PCR检测GAL-3、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-6、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和cyclin D1的mRNA水平;利用Western blot检测GAL-3、MCP-1和IL-6的蛋白表达;利用ELISA检测MCP-1和IL-6在培养基中的水平;通过CCK-8实验和划痕实验检测HUVECs的活力和迁移能力;利用Western blot检测信号分子热休克蛋白90(HSP90)、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK的蛋白水平。结果:首先,给予GAL-3重组蛋白处理后,GAL-3、MCP-1和IL-6的mRNA及蛋白水平,MMP-9和cyclin D1的mRNA水平,MCP-1和IL-6在培养基的分泌水平均明显高于正常对照组;而GAL-3-shRNA感染细胞后,上述分子的表达水平均低于正常对照组和阴性对照组。其次,GAL-3重组蛋白处理后,细胞活力和迁移能力明显高于正常对照组;而GAL-3-shRNA感染后,细胞活力和迁移能力均低于正常对照组和阴性对照组。此外,GAL-3重组蛋白处理组中,p-ERK1/2和HSP90的蛋白水平高于正常对照组;而GAL-3-shRNA组中,p-ERK1/2和HSP90的蛋白水平均低于正常对照组和阴性对照组。p-JNK的蛋白水平在各组间比较,差异无统计学显著性。结论:GAL-3促进血管内皮细胞的生长、迁移及炎症反应的发生,其机制可能与HSP90-ERK1/2信号通路有关。

重组人附睾特异表达蛋白ESC42及其生物学鉴定

目的:利用基因工程技术合成出人附睾特异表达基因ESC42重组蛋白,为其功能研究提供材料。 方法: 从人附睾cDNA文库扩增出ESC42基因片段,构建原核表达载体,进行克隆、表达、蛋白质纯化及单克隆抗体制备; Western印迹鉴定纯化产物及其单克隆抗体的特异性;基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱(MALDI TOF MS)鉴 定ESC42蛋白相对分子质量(Mr)和肽质量指纹,用MS Fit软件查询NCBI数据库。 结果:获得rhESC42融合蛋 白纯度为99%;Mr为11978.12,制备出抗rhESC42单克隆抗体;质谱分析的数据覆盖了所预测氨基酸序列的48%, 且符合率为100%。在Expasy数据库中进行结构域扫描,发现ESC42属于β defensin家族,具有抗菌活性。 结 论:获得了高纯度且具有生物效应的rhESC42重组蛋白质,并从蛋白质水平对预测氨基酸序列进行了证实,为以后 的功能研究奠定基础。

成纤维细胞生长因子21对内质网应激诱导心肌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨成纤维细胞生长因子21(FGF21)在内质网应激(ERS)诱导心肌细胞凋亡中的保护作用及其作用机制。方法:以pc DNA4为基因载体,构建pc DNA4-FGF21质粒并转染H9c2大鼠心肌细胞48h,加入衣霉素(TM)10μM处理24h构建内质网应激模型,实验分为4个组:对照组、衣霉素处理组、pcDNA4-FGF21+衣霉素组、pcDNA4+衣霉素组。利用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测FGF21蛋白及蛋白激酶R样ER激酶(PERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)介导的凋亡通路相关蛋白的表达。利用CCK8检测细胞存活率和TUNEL检测细胞凋亡率。结果:成功构建pcDNA4-FGF21质粒并在H9c2细胞中过表达。与对照组相比,衣霉素处理组和pcDNA4+衣霉素组明显上调H9c2细胞内源性FGF21的表达(P<0.01),以及增加PERK和JNK介导的凋亡通路相关蛋白的表达(P<0.05~0.01),减少细胞存活率和提高细胞凋亡水平(P<0.05~0.01)。与衣霉素处理组和pcDNA4+衣霉素组相比,在pcDNA4-FGF21+衣霉素组明显降低PERK和JNK介导的凋亡通路相关蛋白的表达,增加细胞存活率,降低细胞凋亡水平(P<0.05~0.01)。结论:FGF21过表达可以减轻内质网应激诱导心肌细胞的凋亡,其机制可能部分与抑制内质网应激中PERK和JNK介导促凋亡通路的信号传导有关。

白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学研究的技术探索

建立白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学技术体系，以惠白斑综合征中国对虾的肝胰腺为研究对象，健康中国对虾肝胰腺为对照组，探索2种蛋白质组学差异蛋白的分离和鉴定的方法。采用双向凝胶电泳（4～7固相pH梯度干胶条，10％SDS-PAGE）分离蛋白质组，银染显色，图像分析软件比较分析，识别差异蛋白，胶上扣点，处理后通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MOLDI-TOF）得到肽质量指纹图谱，软件分析后应用Mascot数据库搜索软件鉴定蛋白。分别获得中国对虾患白斑病组及对照组正常肝胰腺蛋白质组表达图谱，分别识别出203和107个蛋白质点，筛选并尝试鉴定数个差异蛋白。对各方法步骤进行了技术探讨，对实验过程提出了一系列建议，建立了双向电泳及生物质谱方法研究中国对虾白斑病的蛋白质组学技术体系，该体系拓宽了对虾免疫生理研究的途径，以从蛋白质水平探讨对虾发病机制，寻找有效药物靶点。

脑脊液CystatinC改变与格林-巴利综合征关系的探讨

目的对格林-巴利综合征(GBS)患者和对照组脑脊液进行蛋白质组学分析,寻找改变最明显的蛋白质,初步探讨其与GBS的关系。方法分别取GBS疾病组和对照组的新鲜脑脊液,冰丙酮沉淀法提取总蛋白,进行第一向等电聚焦电泳(IEF)和第二向十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质组,Image Master 2D图像分析软件对分析胶进行比较分析,识别差异表达明显的蛋白质点。抠取制备胶上相应的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI/TOF/MS)得到肽质量指纹图谱(PMF),搜索SWISSPROT数据库鉴定蛋白质点。结果双向电泳图谱上有6个点在两组间存在明显差异,4个蛋白质点在GBS疾病组中表达明显上调,2个降低。其中Cystatin C表达下调,是改变最明显的蛋白质点,为本实验首次发现。随后的酶联免疫吸附实验(ELISA)也证实GBS患者的脑脊液中Cystatin C的浓度明显低于对照组[(2.79±0.65)mg/L,(3.65±0.82)mg/L,P<0.01]。结论Cystatin C浓度在GBS患者脑脊液中的浓度明显降低,可为研究格林-巴利综合征疾病机制提供线索。

Livin在后发性白内障动物模型中的表达

目的:建立新西兰大白兔后发性白内障(posterior capsule opacification,PCO)动物模型,检测凋亡抑制因子Livin在PCO中的表达,从而探讨Livin在PCO形成过程中的作用。方法:选用健康新西兰大白兔30只,随机分为实验组(25只),分为A,B,C,D,E组,对照组(5只),实验组行右眼晶状体皮质吸出,分别于术后即刻;3,7,14,28d(每个时间点5只)对术眼行裂隙灯显微镜检查,并处死动物获取术眼晶状体后囊膜,对照组直接处死动物获取右眼后囊膜,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blotting方法检测Livin在正常对照组及术后不同时间点PCO中的表达。结果:RT-PCR和Western-blotting在正常对照组及术后即刻A组均未检测到Livin的表达,实验组B,C,D,E术后不同时段的PCO组织中均可检测到不同程度Livin的表达,其中RT-PCR和Western-blotting均显示术后C组Livin表达较为明显,D组表达开始下降,但至E组仍有表达,B组表达最低。结论:Livin的表达在PCO的形成过程中具有相应的时相性,为进一步探索PCO的基因治疗提供了理论依据。

附睾相关WFDC型丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

精子在附睾中的成熟是通过管腔离子浓度的改变及许多糖苷酶和蛋白酶对精子表面膜的修饰过程来调控的,而这些蛋白酶的活动是受存在于附睾特定区域的蛋白酶抑制剂控制的。其中WFDC型丝氨酸蛋白酶抑制剂是一种在附睾中高度表达的蛋白,它在天然免疫与男性生育方面发挥重要作用。本文就该蛋白的结构、功能特征及其在开发男性抗生殖道感染药物、免疫避孕药物等方面的应用前景进行了综述。

离子与离子通道在精子获能中的调控机制

哺乳类动物精子膜上的离子通道,包括Ca2+、Na+、K+、Cl-和HCO3-等通道,在精子获能过程中发挥各自重要的作用。精子获能过程通过Ca2+、HCO3-、活性氧等信号分子,激活可溶性腺苷酸环化酶,在环磷酸腺苷(cAMP)、Ca2+以及胞内pH协作下,经cAMP/蛋白激酶A(PKA)和酪氨酸磷酸化信号转导途径促进精子发生获能相关生物效应。

大鼠附睾蛋白质组的提取和二维液相色谱分离

背景与目的:提取大鼠附睾液蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离附睾蛋白组的方法。方法:分离提取大鼠附睾液蛋白,样品利用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH8.5-4.0之间的组份进行二维反相高压液相色谱分离,最后将获得的二维UV图通过ProteoVue软件转换成PI/UV图谱。结果:成功提取了附睾液蛋白,并通过二维液相色谱成功建立了大鼠头体尾部附睾液蛋白的二维PI/UV图谱,收集了一维色谱聚焦分离的pH8.5-4.0区间的20个组份,并将每个组份进行二维色谱分离后转换为PI/UV图谱。结论:为进一步全面研究附睾蛋白功能和体液差异蛋白质组研究打下了基础。

垂体腺苷酸环化酶激活肽拮抗lactacystin细胞毒性作用的机制研究

目的探讨垂体腺苷酸环化酶活化肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)对蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导的帕金森病多巴胺能细胞凋亡作用的影响及其分子机制。方法用神经生长因子将鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞诱导分化成神经元的细胞模型,经20μmol/L的lactacystin作用24h,建立帕金森病细胞实验模型。实验分为对照组、lactacystin组、PACAP1-27干预组(干预1组)、PACAP1-27和PACAP6-27共同干预组(干预2组)。Western blot法检测线粒体凋亡相关蛋白bcl-2、bax、bcl-2/bax比值、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达情况。结果与对照组比较,lactacystin组bcl-2表达、bcl-2/bax比值明显降低(P<0.01),bax表达无明显变化,Caspase-3表达明显升高(P<0.01);与lactacystin组比较,干预1组bcl-2表达、bcl-2/bax比值明显升高(P<0.01),bax表达无变化,Caspase-3表达明显降低(P<0.01);与干预1组比较,干预2组Caspase-3表达明显升高(P<0.01)。结论蛋白酶体抑制剂lactacystin引起线粒体损伤导致细胞损伤;PACAP1-27通过调节上述信号通路发挥保护作用。而PACAP1-27的受体拮抗剂PACAP6-27则减弱了PACAP1-27的这一作用。

附睾氧化应激研究进展

附睾是男性生殖系统的重要器官之一,负责精子的成熟、转运和储存。附睾功能的实现依赖于其旺盛的生理活性,因而自由基的产生不可避免。自由基过度积累势必造成附睾氧化应激,精子质膜及其DNA发生氧化损伤,极大影响精子运动和受精能力的获得,从而造成男性不育。本文对附睾氧化应激在能量代谢、炎症反应等过程中的产生机制和超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶、吲哚胺双加氧酶、还原性谷胱甘肽及硫氧还蛋白等物质的抗氧化作用进行了综述,以期为男性不育症的有效预防、诊断和治疗提供新思路。

人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5α,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101~108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%~3.29%以及3.10%~5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。

孤雌生殖和孤雌胚胎干细胞研究进展

孤雌生殖是没有精子参与的卵母细胞激活分裂和发育过程。孤雌生殖技术是获得组织相容性胚胎干细胞系的一项重要技术。孤雌胚胎干细胞既具有与正常胚胎干细胞相同的自我更新和多向分化潜能,又规避了人胚胎干细胞面临的伦理问题,日益受到重视。但孤雌胚胎干细胞系存在建系率低、分化能力有限和异常基因印迹等诸多问题,原因可能与缺乏父本基因有关。目前已经建立了小鼠、猴和人类的孤雌胚胎干细胞系。就近年孤雌生殖和孤雌胚胎干细胞的研究进展综述。

实时荧光定量PCR技术在医学诊断中的应用

实时荧光定量PCR是近年来发明的一种核酸检测技术，因高精确度、高灵敏性、污染少等优点已在生物医学基础科研及医学临床中得到广泛应用，本文就该技术在医学诊断方面的应用作简要综述。

HSPA5研究进展

HSPA5是热休克蛋白70家族成员之一，作为一种分子伴侣在蛋白质折叠和转运过程、内质网应激反应和精子发生过程中发挥重要作用。他在多种肿瘤组织中呈高表达，反义抑制其表达水平或将HSPA5启动子连接自杀基因可用于肿瘤治疗。在小鼠和人的生精过程中的不同表达暗示在精子的生理功能中可能扮演重要角色。