烟草转基因研究常用遗传元件筛查策略

通过检索国内外近10年烟草转基因研究的相关文献,建立了转基因烟草常用转化遗传元件的数据库,统计了每个遗传元件及组合元件的使用频率后,发现利用7种遗传元件,包括:启动子P-35S、标记基因NPT II、HPT、Bar和aadA、报告基因GUS及终止子T-NOS作为靶标元件组合,能使目前烟草转基因事件的理论筛查率达到100%,从而构建出转基因烟草的优化筛查策略。

赤星病胁迫对不同抗性烟草品种光合作用和叶绿素荧光特性的影响

以不同烟草赤星病抗性品种JYH(抗病品种)和CBH(感病品种)为材料,在盆栽试验条件下,调查不同烟草赤星病胁迫程度(轻度胁迫、中度胁迫和重度胁迫)对光合色素含量、光合作用参数和叶绿素荧光动力学特征的影响。结果显示:1)烟草赤星病胁迫导致2个品种的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均呈下降趋势,且JYH的降幅小于CBH。2)除JYH的净光合速率在轻度胁迫下有所增加外,JYH、CBH的净光合速率、气孔导度因烟草赤星病胁迫而降低。2个品种的胞间CO2浓度、气孔限制值变化具有明显差异,烟草赤星病胁迫导致CBH的胞间CO2浓度上升,气孔限制值则明显下降,这与JYH在重度胁迫下的变化趋势一致。而JYH的胞间CO2浓度在轻度、中度胁迫降低,气孔限制值则呈上升趋势。3)烟草赤星病胁迫下,2个品种的初始荧光(F0)、非光化学猝灭系数(NPQ)均有所增加。重度胁迫下,JYH、CBH的F0分别比对照增加16.5%、34.48%,NPQ分别上升95.54%、137.45%,差异均达到显著水平。而各品种的最大荧光(Fm)、可变荧光(Fv)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/F0)、光化学淬灭系数(qp)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)在烟草赤星病胁迫下均呈下降趋势,降幅表现为JYH<CBH。研究结果表明,JYH的光合色素、光合作用和叶绿素荧光特性受烟草赤星病胁迫影响小于CBH,维持较高的光合性能是对烟草赤星病具有较强抗性的生理基础。

烟草赤星病胁迫对不同抗性品种光合特性和渗透调节的影响

以抗烟草赤星病品种净叶黄(JYH)和感病品种长脖黄(CBH)为材料,在盆栽试验条件下,研究不同烟草赤星病胁迫程度(轻度胁迫、中度胁迫和重度胁迫)对光合特性和渗透调节的影响。结果显示:⑴烟草赤星病胁迫导致2个品种的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均呈下降趋势,且JYH的降幅小于CBH。⑵JYH、CBH的净光合速率、气孔导度因烟草赤星病胁迫而降低。2个品种的胞间CO2浓度、气孔限制值变化具有明显差异,烟草赤星病胁迫导致CBH的胞间CO2浓度上升,气孔限制值则明显下降,这与JYH在重度胁迫下的变化趋势一致。而JYH的胞间CO2浓度在轻度、中度胁迫降低,气孔限制值则呈上升趋势。⑶与CBH相比,JYH在烟草赤星病胁迫下具有较高的脯氨酸和可溶性总糖含量,较低的MDA含量。研究结果表明,JYH具有较强的光合作用和渗透物质调节能力,是对烟草赤星病胁迫具有较强抗性的生理基础。

烟草CYP82E4v1基因调控降烟碱的生物合成

为明确烟草烟碱去甲基酶基因CYP82E4v1在降烟碱生物合成中的调控作用,通过农杆菌介导,将含CYP82E4v1超量表达的植物表达载体pLF-35S-CYP和干涉表达的植物表达载体pLF-35S-CYPi分别遗传转化烟草品种K326,共获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。HPLC测定表明,超量表达植株降烟碱含量比对照烟草品种K326高88.9%,而干涉表达植株降烟碱含量比对照烟草低61.1%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因的表达为对照烟草的20倍以上,在干涉表达植株中其表达量仅为对照烟草的6%。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的"Gene-deletor"表达元件,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源GUS∷NPT II基因,从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。

烟草内生细菌多样性研究

为了揭示烟草内生细菌多样性,选择K326、云85和红花大金元3个烤烟品种进行内生细菌的分离和16S r DNA序列分析鉴定,获得不同品种烟草内生细菌的多样性特征。结果显示,27株内生细菌分别属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(33%)、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides(4%)、芽孢杆菌属Bacillus sp.(11%)、肠杆菌属Enterobacter sp.(4%)、寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.(4%)、热带根瘤菌Rhizobium tropici(4%)、假单胞菌属Pseudomonas sp.(4%)、土地芽孢杆菌属Terribacillus sp.(4%),芽孢杆菌属Bacillus sp.为优势细菌类群。3个品种的Shannon index(H′)以K326最高、为2.02,其次是云85、为1.48,红花大金元最低、为1.3。

烟草糖基转移酶基因NtGT5a的克隆及原核表达

为揭示烟草糖基转移酶的活性及生物学功能,从烟草栽培品种中克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT5a,基于GenBank的烟草糖基转移酶基因NtGT5a的核苷酸序列(GenBank登录号AB176523),设计并合成特异性引物,以红花大金元叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得了烟草糖基转移酶基因NtGT5a的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1458 bp,编码485个氨基酸残基,推测的蛋白分子量为54.21 kDa,理论等电点为5.41。通过构建重组表达载体pCold-SUMO-NtGT5a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在15Ⅲ下经0.2 mmol/L IPTG诱导22 h表达产生了SUMO-NtGT5a重组蛋白。重组蛋白部分以包涵体形式存在,部分以可溶性蛋白形式存在。将重组蛋白的可溶性组分经过Ni-NTA柱层析纯化和凝胶过滤层析,用SUMO蛋白酶切除SUMO标签,再用镍柱纯化获得了高纯度的NtGT5重组蛋白。

普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析

基于NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因(ABE99707)的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以烟草栽培品种红花大金元叶片总RNA为模板,通过PCR方法获得了烟草NtPDS基因的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1749 bp,编码582个氨基酸,推测该蛋白等电点为7.53,理论分子量为65.04 kD。通过构建融合表达载体pET-32a-NtPDS,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下经1 mmol/L IPTG诱导4 h表达后,产生了以可溶性蛋白形式存在的NtPDS融合蛋白,并通过Western blotting验证融合蛋白获得表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在烟草的叶片、花和茎中均有表达,在根中没有表达。该结果为进一步研究烟草八氢番茄红素脱氢酶NtPDS的活性和生物学功能奠定了基础。

不同海拔高度烟草叶片组织结构和质体色素特性研究

以红花大金元为试验材料,采用大田试验研究烟叶的组织结构和质体色素在不同海拔高度下的变化特征。结果显示,叶片在达到长度20 cm前,高、低海拔烟叶的组织学厚度和栅栏细胞密度差异均不明显;但在达到叶长20 cm后,高海拔烟叶的组织厚度较薄,而栅栏细胞较密。高海拔烟叶的叶绿素a、叶绿素b含量和叶绿素总量在叶长50 cm前均较低,但烟叶在高海拔条件下具有较高含量的类胡萝卜素,且叶绿素a/叶绿素b、类胡萝卜素/叶绿素比值也较大。研究表明,高、低海拔高度条件下烟叶的组织结构和质体色素含量明显不同,造成细胞结构和光合作用差异明显,从而导致不同海拔高度烟叶的内在质量风格出现差异。

烟草NtCBT基因启动子酵母单杂诱饵载体构建及互作蛋白筛选

为了筛选烟草类西柏烷生物合成途径中西柏三烯一醇合酶基因(NtCBT)的上游调控转录因子,将NtCBT基因启动子截为6段(P1-P6区域),分别构建酵母单杂诱饵载体pAbAi-Px,将pAbAi-Px转化Y1H酵母感受态细胞构建诱饵菌株并进行自激活检测,从烟草腺毛酵母cDNA文库中筛选与P5区域(-279--119 bp)互作的转录因子。结果表明,P1-P5区域所构建的诱饵菌株,在AbA浓度为200 ng/mL时转录自激活得到有效抑制;在以P5区域为诱饵菌株的筛库实验中,共获得49个阳性克隆,去除冗余序列后35个克隆为非重复序列,其中3个克隆注释为ANL2、ML1及NF-Y转录因子。以上结果为进一步研究NtCBT基因的表达调控机制奠定了基础。

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的克隆及组织表达谱

为揭示牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)小亚基在烟草(Nicotiana tabacum)中的生理功能,采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到1个牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的cDNA序列,命名为NtGGPPS5(GenBank登陆号:KF316932)。该基因全长1320 bp,编码332个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum,XP_004246572)及其野生种(Solanum pennellii,ADZ24721)的GGPPS小亚基的氨基酸序列一致性均为92%,具有一个特征性的异戊二烯合成酶保守的天门冬氨酸富集区。进化分析表明,植物GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS5属于小亚基。实时荧光定量PCR试验表明,NtGGPPS5基因在烟草根、茎、叶和芽中均有表达,表达量为芽>叶>茎>根。

不同烟草赤星病抗性烤烟品种成熟期叶片氮代谢的差异

以抗赤星病的净叶黄和感赤星病的NC89、长脖黄的不同烤烟品种为材料,采用盆栽试验分析成熟期不同抗性烤烟品种叶片的氮转运差异.结果表明:随着叶片的成熟,3个品种质外体NH+4的浓度均逐步增大,长脖黄、NC89质外体NH+4的浓度显著大于净叶黄;3个品种的谷氨酰胺合成酶(GS)活性均急剧下降,净叶黄的GS活性极显著大于NC89和长脖黄;3个品种的总氮含量和叶片组织NH+4浓度明显下降,长脖黄、NC89具有较高的氨气补偿点,极显著高于净叶黄.可见:不同赤星病抗性烤烟品种成熟期叶片的氮运转能力具有明显差异,抗病品种叶片的氮素再利用能力大于感病品种;感病品种以叶片质外体氨挥发形式损失的氮素多于抗病品种.

烟草类胡萝卜素异构酶基因的电子克隆及生物信息学分析

为从烟草中克隆烟草类胡萝卜素合成途径中的关键类胡萝卜素异构酶基因,运用电子克隆的方法,以番茄CRTISO基因为探针,分离编码CRTISO基因的cDNA序列,并对其进行序列分析。结果表明:该基因编码区为1 716bp,编码571个氨基酸残基。烟草CRTISO蛋白为亲水性稳定蛋白,相对分子量为61.65kDa,理论等电点为8.48,蛋白质二级结构中的主要构成元件是α-螺旋和无规则卷曲。NtCRTISO蛋白含有16个丝氨酸激酶磷酸化位点,5个苏氨酸激酶磷酸化位点,3个酪氨酸激酶磷酸化位点,定位在线粒体内膜的概率为0.721。系统进化树分析表明,烟草CRTISO与其他高等植物类胡萝卜素异构酶亲缘关系比较近。

烟草病毒抗性相关基因SGT1的电子克隆及序列分析

为研究烟草病毒抗性信号通路基因(SGT),以番茄(Solanum lycopersicum)信号通路基因slSGT1-2为探针,利用电子克隆的方法从栽培烟草品种珊西烟中克隆信号通路基因,并对其进行了序列分析。结果表明:成功克隆到的信号通路基因cDNA序列1 041bp,包含完整的开放阅读框,编码346个氨基酸,具有23kD类SGT1蛋白结构域(p23-SGT1like domain)。分子式为C1719H2707N441O509S16,分子量为38 209Da,理论等电点为5.35,属于稳定蛋白;在275~308氨基酸处形成1个跨膜区,N端以螺旋为主,C端在螺旋中出现折叠。NtSGT1氨基酸序列与番茄SGT1-2基因编码蛋白一致性达到90%,而与已报道的野生烟基因相比C端区域缺少部分保守结构域。说明,NtSGT1是烟草中未报道的病毒抗性信号通路基因。

烟草子房注射法转基因试验

为了快速获得转基因烟草,对烟株子房注射处于对数生长期的含有外源基因的根癌农杆菌菌液。结果表明:通过初步的50mg/L Kana抗性筛选及PCR检测,烟草子房注射法能成功获取转入的外源基因得到转基因烟草。烟草子房注射法与烟草叶盘转化法等常规转基因方法相比,子房注射法简化了试验过程,缩短了试验周期,提高了试验效率。

烟草植物螯合肽合成酶PCS1基因的电子克隆和序列分析

为了研究烟草中重金属镉的代谢转运基因,以马铃薯的植物螯合肽合成酶phytochelatin synthases 1(PCS1)基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:AJ548472.1)为信息探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因(NtPCS1),并对其进行了序列分析。序列分析结果:NtPCS1包含完整的开放读码框,编码531个氨基酸,含有2个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin;通过同源比对和进化分析发现,NtPCS1氨基酸序列与番茄PCS1的序列一致性达到85%,与已报道的树烟草NgPCS相比,在N端多出30个氨基酸。以上结果表明NtPCS1是栽培烟草中新发现的金属镉代谢转运基因。

烟草E3泛素连接酶NtHOS1a和NtHOS1b基因的克隆与表达分析

为明确与烟草低温早花有关的调控基因,利用生物信息学方法结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆了2个E3泛素蛋白连接酶HOS1基因cDNA全长序列,分别命名为NtHOS1a(Gen Bank登录号:KU558689)和NtHOS1b(Gen Bank登录号:KU558690)。NtHOS1a基因全长为3 599 bp,编码963个氨基酸;NtHOS1b基因全长为3 578 bp,编码954个氨基酸;两基因氨基酸序列的一致性为95%,与拟南芥HOS1蛋白(NP_181511)的序列一致性分别为51%和50%。两基因编码蛋白的N末端均含有一个E3泛素连接酶特征的环指结构域。荧光定量PCR分析表明:在正常生长条件下,NtHOS1a和NtHOS1b在烟草根、茎、叶中表达强烈,12℃低温处理10 d后两基因在烟草根、茎、叶中的表达量均有不同程度的降低,说明在烟草根、茎、叶组织中NtHOS1a和NtHOS1b的表达量受低温胁迫的负向调控。

烟草蛋白酶体α2型亚单位的克隆和序列分析

为研究烟草识别病毒并将其降解为蛋白酶体基因,以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长c DNA序列(Gen Bank登录号:AF043520.1)为信息探针,用电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个蛋白酶体基因Nt PAB1,并对其进行序列分析。结果表明,Nt PAB1包含完整的开放读码框,编码219个氨基酸,含有1个保守域proteasome_alpha_type_2;通过同源比对和进化分析发现,Nt PAB1氨基酸序列与葡萄PAB1的序列一致性达到98%。以上结果表明,Nt PAB1是栽培烟草中未报道的编码蛋白酶体基因。

烟碱去甲基化酶及降烟碱相关遗传改良研究进展

综述了近年国内外烟碱去甲基化分子机制方面的研究进展:烟碱去甲基化过程所需要的关键酶属于烟草内源P450氧化酶的亚型之一,该酶在普通栽培烟草中存在多个等位基因版本,其中多数在现代烟草中失活,主要的催化活性来自CYP82E4和CYP82E5,这两个基因的主要诱导因素为衰老及烟草中的转化现象;介绍了烟草遗传育种领域各种阻断烟碱去甲基化以及降低降烟碱积累的遗传改良方法;并结合近年来发展起来的育种新技术对如何降低烟叶中的烟草特有亚硝胺的分子育种进行了展望。

酚酸对烟苗根系生长及叶片光合特性的影响

为了解酚酸类他感物质对烟苗生长发育的影响,研究了苯甲酸、对羟基苯甲酸和水杨酸对烟苗根系发育、气体交换特征、叶绿素荧光参数及叶绿素含量的影响。结果表明,3种酚酸随着浓度的增加,烟苗叶片叶绿素含量(SPAD值)均呈先增加后降低趋势;3种酚酸能够显著抑制烟苗根系发育,随着浓度增加,根尖数、总根长和总根表面积呈先升后降或直接降低的趋势;3种酚酸能够降低净光合速率(Pn),苯甲酸差异不显著;3种酚酸对叶绿素荧光参数均有影响,随着浓度的增加,Fv/Fm有降低趋势,但差异不显著,qp和ФPSII呈显著下降趋势,NPQ呈显著升高趋势。本试验证明了3种酚酸对烟苗根系发育、光合作用有抑制作用。

根系提取物对烤烟的自毒作用研究

为了明确连作烤烟的自毒作用,研究了烤烟根系提取物对烤烟种子萌发、烟苗干物质积累、烟苗根系生长发育及烟苗光合参数的影响。结果表明,随着根系提取物浓度的增加,烤烟种子发芽率、烟苗根系总根长、总根面积、总根体积、根尖数、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率逐渐降低;平均根系直径,烟苗地上部干、湿重,地下部干、湿重及总干、湿重,总叶绿素含量,净光合速率均表现为先升高后降低的趋势;气孔限制值逐渐升高。烟草根系提取物对烤烟种子萌发及烟苗生长发育具有明显的抑制作用。