中国烟草种质资源分发利用情况分析

烟草种质资源是烟草新品种选育、遗传理论研究、生物技术研究和烟叶生产的宝贵资源和重要战略物资,也是我国烟草行业能否健康快速发展的关键所在。本文详细统计分析了1983-2014年这32年间我国烟草种质资源的分发利用情况,尤其是自2007年国家烟草专卖局正式启动"中国烟草种质资源平台建设"专项以来我国烟草种质资源的利用效果。阐述了当前我国烟草种质资源收集保存和利用研究上存在的问题,并提出了今后加强完善我国烟草种质资源工作的相关对策。旨在为我国烟草种质资源的进一步收集、保存以及更加全面充分的利用提供理论和应用基础。

普通烟草WRKY基因家族的鉴定及表达分析

WRKY 基因家族编码产物是一类含有 WRKY 保守结构域的转录因子（Transcription factors, TFs），在植物的生长发育、胁迫应答等过程中起着重要的作用。目前，已在多种植物中鉴定了 WRKY 基因家族，但在普通烟草（Nicotiana tabacum L.）中 WRKY 家族的系统鉴定与分析还未见报道。本研究利用 WRKY 保守域全蛋白序列 PF03106检索普通烟草蛋白序列，获得 WRKY 家族候选序列共164个。利用多种生物信息学软件对该家族成员进行了系统进化树、保守结构域、亚细胞定位预测、染色体定位和组织表达等分析。分组鉴定和进化树分析结果显示，可将164个候选 NtWRKY 蛋白分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个亚家族。其中，Ⅱ亚家族又可细分为Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d 和Ⅱ-e 共5个亚组。WRKY 结构域分析结果显示，多数基因由2~5个外显子组成，各成员间的核心结构域高度保守，含有 WRKY 盒和锌指结构。亚细胞定位预测结果显示，大部分 NtWRKY 成员都定位在细胞核中，参与核基因的转录调控；而第Ⅲ亚家族的大部分成员（74%）定位于细胞质基质中，可能参与细胞质基因的转录调控。染色体定位结果显示，共有154个 NtWRKY 基因能够定位于24条染色体中，且呈不均匀分布，6号染色体上分布最多，含16个候选基因，10号染色体上分布最少，只有1个候选基因。组织表达分析结果显示，大部分 NtWRKY 基因在烟草根、茎、叶中都有表达，但不同基因间的表达模式存在差异，这暗示了烟草 NtWRKY 家族的不同成员在功能上可能具有多样性。研究还发现基因 NtWRKY26、NtWRKY30、NtWRKY32的表达模式受黑胫病原菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）诱导，可能与烟草-黑胫病菌互作机制相关。本研究不仅为研究普通烟草 WRKY 转录因子在调控生长发育过程中的作用奠定了相关理论基础，也为进一步分析普通烟草 WRKY 基因提供了有价值的信息。

普通烟草ARF基因家族序列的鉴定与表达分析

ARF(AUXIN RESPONSE FACTOR)基因含有一个B3功能域和具有转录激活或抑制活性的中心功能域,在植物发育过程中起到非常重要的作用。本研究采用生物信息学方法,根据拟南芥ARF基因序列鉴定了普通烟草基因组中的ARF基因,并对家族成员进行了序列特征、系统发生、亚细胞定位和表达模式分析。目前在普通烟草基因组中共得到50个ARF基因成员,其基因结构相对复杂,一般含有10个外显子。亚细胞定位结果表明,少数ARF蛋白定位到线粒体或叶绿体,大多数未检测到定位信号。转录组数据分析表明,ARF基因具有不同的组织表达模式,部分基因表现出组织特异性。这些研究结果为普通烟草ARF基因家族功能的深入研究奠定了基础。

普通烟草LBD基因家族的全基因组序列鉴定与表达分析

LBD是一类具有LOB（lateral organ boundaries）结构域的基因家族,在植物发育过程中起到非常重要的作用。采用生物信息学方法,根据拟南芥LBD基因序列鉴定了普通烟草基因组中的LBD基因,并对家族成员进行了序列特征、系统发育和表达谱分析。结果表明：普通烟草基因组中共有98个LBD基因成员,其基因结构相对简单,一般含有1~3个外显子。LBD基因家族可分成I和II两大类,两类均含有CX_2CX_6CX_3C保守结构域,但II类不含有LX_6LX_3LX_6L形成的＂卷曲螺旋＂二级结构,根据与拟南芥LBD蛋白构建的系统发育树则可细分成5个亚家族（Ia、Ib、Ic、Id和II）。将LBD基因与表达序列标签（EST）比对,发现36个基因有EST证据;EST、芯片数据和转录组数据分析表明：LBD基因具有不同的组织表达模式,部分基因表现出组织特异性。这些研究结果为普通烟草LBD基因家族功能的深入研究奠定了基础。

烟草品种Beinhart1000-1抗黑胫病基因的QTL定位

为研究烟草黑胫病不同亲本来源的抗性遗传规律,定位抗性基因位点,本研究利用抗黑胫病品种Beinhart1000-1构建了220个F2分离群体。通过病圃接种鉴定和遗传分析,确定Beinhart1000-1对烟草黑胫病的抗性由多基因控制。利用筛选到的70对稳定SSR引物对烟草黑胫病抗性进行了QTL分析,绘制了一张包含14条染色体的遗传连锁图谱,且定位到5个与烟草黑胫病抗性紧密相关的QTLs,分别在2、3、3、6、12号染色体上,其贡献率分别为6.2%、6.0%、6.7%、5.6%和5.1%。此结果使烟草黑胫病抗性研究进一步深入,推进了烟草黑胫病分子标记辅助选择。

烟草细胞质雄性不育线粒体基因sdh3和sdh4的生物信息学分析

线粒体基因异常可能导致烟草细胞质雄性不育。sdh3、sdh4是编码线粒体电子传递链复合体II亚基的重要基因,为探讨线粒体基因sdh3、sdh4与细胞质雄性不育的关系,从3个普通烟草不育系品种及其保持系中提取线粒体DNA,根据GenBank报道的烟草线粒体DNA序列设计特异引物扩增目的基因并克隆测序,应用生物信息学方法,分析烟草雄性不育系及保持系的sdh3、sdh4基因在其核苷酸、编码蛋白各结构层次上存在的差异。结果显示,不育系的sdh4基因第28位碱基发生了改变;不育系的sdh3基因发生10个碱基的缺失,以致其编码蛋白改变,这极可能成为干扰线粒体琥珀酸脱氢酶亚基3功能的关键因素,从而成为可能导致烟草CMS的根本原因之一。

普通烟草钙依赖蛋白激酶NtCDPK15的基因克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)对Ca2+信号转导通路下游元件的调控具有重要作用。本实验采用同源克隆技术从普通烟草中分离得到1个CDPK基因,命名为NtCDPK15(GenBank登录号为JN662020),cDNA全长为1963 bp,ORF大小为1569 bp,编码522个氨基酸。多序列比对结果表明,NtCDPK15的编码产物具有典型的CDPK保守序列,C末端调控区有4个EF手性结构。系统进化树分析显示,NtCDPK15可能来源于绒毛状烟草,预测NtCDPK15与NtCDPK1这对旁系同源基因在功能上可能非常保守。实时荧光定量PCR分析结果表明,NtCDPK15在根和叶中的表达量显著高于茎中的表达量,但经盐胁迫诱导后NtCDPK15在茎中的表达量显著增加,同时,盐胁迫还使基因在叶中的表达量显著上调,ABA胁迫可诱导基因在根中的表达,而干旱胁迫可使基因在根和叶中的表达量下调,这些结果说明NtCDPK15在普通烟草中的表达受盐胁迫及ABA胁迫诱导,但受干旱胁迫抑制。

烟草BRANCHED1-Like基因的克隆及表达分析

TCP转录因子家族CYC/TB1簇中成员BRC1在调控植物侧枝发育的过程中发挥重要作用。本研究利用电子克隆结合RT-PCR方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆获得4个Nt BRC1-Like基因,分别命名为Nt BRC1-Like1、Nt BRC1-Like2、Nt BRC1-Like3和Nt BRC1-Like4。4条基因的CDS序列长度分别为1140 bp、1062 bp、987 bp和1041 bp,分别编码由379、353、328和346个氨基酸组成的蛋白,这4个蛋白与CYC/TB1簇中其他成员具有较高相似性。蛋白质保守结构域分析表明,4个Nt BRC1-Like基因编码的蛋白除具有TCP核心结构域外,还具有CYC/TB1簇蛋白特有的R结构域。系统进化树分析表明,Nt BRC1-Like蛋白都是TCP家族CYC/TB1簇中的成员,且4个Nt BRC1-Like蛋白可以被分成2组,Nt BRC1-Like1和Nt BRC1-Like4为一组,Nt BRC1-Like2和Nt BRC1-Like3为另一组。荧光定量PCR分析发现,4个烟草Nt BRC1-Like基因的表达呈现明显的组织特异性,且其表达模式可分为2种:Nt BRC1-Like1和Nt BRC1-Like4的表达模式相似,在腋芽中有极高的表达;Nt BRC1-Like2和Nt BRC1-Like3的表达模式十分相似,在叶和腋芽中的表达量都显著高于其他组织。推测烟草BRC1基因可能存在类似番茄BRC1基因在功能上保守与进化的情况。

影响烟草香气物质合成代谢途径关键酶基因的研究进展

文章详细叙述了与植物香气物质合成有关的3类主要合成代谢途径,并分别归纳苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径和生物碱合成途径中催化主要中间产物形成的关键酶基因功能与表达模式,重点阐述关键酶基因在烟草中的最新研究进展,提出目前除了在基因水平上进行表达水平调控、转基因作物改良之外,烟草中亟待进行更为深入的蛋白水平研究和代谢网络互作分析。通过上述分析,对下一步利用代谢工程改良烟草香气品质及其在农业生产领域的应用前景进行了展望。

NtabEXPA12基因过表达对烟草叶片发育及抗逆性的影响

细胞壁松弛因子膨胀素在调控植物生长发育和响应非生物胁迫等方面发挥重要作用,克隆烟草膨胀素基因并研究其功能可为烟草叶片发育调控和抗逆育种提供理论依据。本研究从普通烟草K326中克隆了一个膨胀素基因NtabEXPA12及其启动子ProNtabEXPA12,通过实时荧光定量PCR、亚细胞定位和过表达等对该基因进行了功能研究,分析了启动子包含的顺式作用元件和活性。结果表明,NtabEXPA12在烟草叶片中具有较高的表达量;ProNtabEXPA12中包含多个响应高盐、干旱和植物激素的顺式元件,并且其活性受到高盐、干旱和ABA等的诱导;过表达NtabEXPA12通过调控细胞扩展促进转基因烟草叶片的生长发育,并可以提高转基因K326对高盐和干旱的抗性。因此,NtabEXPA12在烟草叶片发育调控及抗逆育种中具有潜在的应用前景。

烟草GA代谢相关基因ga1和ga2的克隆和表达分析

为了解赤霉素(gibberellic acids,GA)在烟草生长发育中的作用,本研究利用同源克隆和RACE技术分离了3个烟草种GA代谢相关基因ga1和ga2的6条序列,对其进行了序列比对和进化分析;并利用荧光定量表达分析研究了其在林烟草和普通烟草中的表达谱。结果表明,相关基因在烟草属和茄科作物中保守性很高;普通烟草中克隆的ga1和ga2可能起源于绒毛状烟草。表达分析表明,ga1和ga2在林烟草生长发育早期和茎伸长期分别在叶和茎中的表达量显著高于其他组织。

烟草CHS基因RNA干扰载体的构建及其遗传转化

类黄酮化合物是烟草香气形成的重要前体物质,其形成需要多个调控基因的参与,查尔酮合成酶基因(CHS)是类黄酮物质合成途径中的关键基因,它的突变或沉默可能影响香气物质的形成。为了探讨CHS基因的下调表达对烟草香气的影响以及为选育优良的高香气品种提供技术,采用GATEWAY技术经BP反应和LR反应将CHS基因片段重组到表达载体pH7GWIWG2(I)上,成功构建了具有反向重复序列的CHS基因的RNAi表达载体,并通过农杆菌介导法转染烟草‘大白筋599’,以期为研究CHS基因在烟叶香气物质方面的作用奠定基础。经过鉴定,获得24株阳性转基因‘大白筋599’。

基于基因组的绒毛状烟草和林烟草microRNA及其靶基因分析

【目的】填补绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和林烟草(Nicotiana sylvestris)在miRNA相关领域的研究空白,揭示普通烟草(Nicotiana tabacum)的生长发育调控机理。【方法】在绒毛状烟草和林烟草全基因组中预测并分析miRNA及其靶基因,通过同源比对及miRNA前体二级结构特征进行预测:参考序列在绒毛状烟草和林烟草基因组的比对中,允许最多1—2个错配;miRNA二级结构为经典茎环结构,其中MEF最大值为-25,MEFI最小值为0.85,预测的miRNA与已知的同一家族的miRNA位于发夹结构的同一条臂上;去除E值小于等于1e-6的编码蛋白的序列。【结果】在绒毛状烟草中得到39个家族的162条miRNA,包括14对正/反义miRNA和5个基因簇。在林烟草中得到40个家族的169条miRNA,包括13对正/反义miRNA和3个基因簇。2个野生烟草在保守度高的miRNA家族中,其成员分布相似,且成员数相近。在保守度相对较低的家族中,2个野生烟草其成员分布差异较为明显,其中,miR5021、miR5203等9个家族仅在绒毛状烟草中有成员,miR1446、miR1509等10个家族仅在林烟草中有成员。2种野生烟草的正义miRNA与反义miRNA都有着1—4个碱基差异,这些差异位点在不同的家族中呈现出偏好性,而且在2种野生烟草中偏好性相似:miR164家族的9、12、13个碱基处,miR172家族的1、21个碱基处,miR396家族的2、17个碱基处,miR399家族的15、20个碱基处。2种野生烟草的基因簇主要是由miR156、miR169家族组成,其前体的间距小于350 nt,同时在绒毛状烟草中首次发现miR6019/miR6020基因簇。以普通烟草的unigene数据库作为靶基因集进行预测与分析,在绒毛状烟草122条miRNA中得到749个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因206条,其中89条(43%)得到GO功能注释;在林烟草中117条miRNA得到650个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因169条,其中78条(46%)得到GO功能注释。在分子功能方面,大多数靶基因具有结合等活性。在生物学过程中,靶基因主要参与了发育过程、生殖过程、多细胞器官发育过程、胁迫应答过程等。【结论】控制发育和多细胞器官发育过程的靶基因数方面以林烟草居多,而胁迫应答的靶基因数以绒毛状烟草较多。

普通烟草外向整流Shaker K^(+)通道NtSKOR1的组织表达分析

外向整流Shaker K^(+)通道SKOR(Stelar K^(+)outward rectifier)是一类定位于植物根部中柱细胞质膜的外向整流Shaker K^(+)通道。为探究普通烟草NtSKOR1的启动子活性和不同时期组织表达情况,克隆该基因上游2439 bp的启动子序列,创制启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的烟草材料并进行组织化学染色,通过RT-qPCR验证该基因的表达。结果表明NtSKOR1启动子含有光响应、逆境胁迫和激素等相关的顺式作用元件;转ProNtSKOR1::GUS烟草的组织化学染色试验表明:萌发期至子叶展平期未检测到GUS活性;小十字期,在真叶叶脉和茎尖分生组织开始检测到GUS活性;生根期,除茎和叶脉的维管组织外,在根部维管组织也开始检测到明显GUS活性,且活性随烟株生长而逐渐增强;盛花期,主要在烟草的根、茎和叶脉维管组织检测到活性,且上部叶叶脉中的GUS活性高于下部叶叶脉。RT-qPCR与GUS活性检测结果基本一致。综上可知,NtSKOR1主要在烟草小十字期及后续发育阶段的根、茎、叶的维管组织中表达,烟草进入盛花期后,该基因在光合作用较强的上部叶中的表达高于下部叶,推测该基因可能参与烟草K^(+)转运和同化产物协同运输。

烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析

[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析。[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况。[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达。[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据。

烟草NtbHLH112基因的克隆、鉴定及表达模式分析

bHLH转录因子在植物响应逆境胁迫过程中起着极为重要的调控作用,克隆和验证烟草中bHLH相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究从普通烟草品种K326中克隆出一个NtbHLH112基因,通过生物信息学方法分析了NtbHLH112功能结构域,利用亚细胞定位及转录激活试验进行了功能鉴定,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,NtbHLH112具有典型的bHLH结构域且进化较为保守,定位在细胞核,具有转录激活的活性。进化分析表明,NtbHLH112与番茄Slb HLH112和辣椒CabHLH112同源。表达模式分析表明,NtbHLH112基因具有组织表达特异性,在叶部表达量较高,并且受到盐、干旱、冷胁迫及ABA处理诱导。因此,NtbHLH112转录因子可能在烟草非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

【背景和目的】NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。【方法】进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。【结果】(1)生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;(2)亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;(3)表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H2O2处理诱导;(4)NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。【结论】NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。

基于高密度SSR连锁群的烟草致香物质关联分析

烟叶致香物质是烤烟品质及香型风格的物质基础,是烟草品质改良的重点之一。采用气相色谱方法,对11份不同香型风格的烟草种质进行了52种致香成分的检测,同时采用1条高密度连锁群上的62个SSR位点对其进行了分子标记位点分型。通过标记-性状关联分析,发掘到17种烟草致香物质的24个关联位点。大多数位点关联到了多种致香成分。对供试材料的连锁不平衡分析,发现该连锁群存在2个单倍型,单倍型tsHap1_1由位点52429和53840组成,未发现其与致香物质相关联;单倍型tsHap1_2由3个相邻的位点61443、52305和55052组成,总长度3.012cM,研究发现该单倍型与9种致香物质关联。本研究发掘的关联位点和单倍型,可用于烟草高香气育种分子标记辅助选择。

新型烟草制品未来发展探讨

在愈来愈严峻的控烟形势下,国内外烟草生产者把研究和开发下一代烟草制品或替代品作为发展的重要目标和竞争焦点,我国在新型烟草制品研发领域尚处于起步阶段。概述了当前国内外主要新型烟草制品的特点及发展现状,分析了我国发展新型烟草制品面临的问题与优势,探讨了新型烟草制品在我国未来发展的方向。

抗PVY烟草种质的遗传多样性分析

利用SSR标记对78份抗PVY烟草种质进行遗传多样性分析,根据类型将78份材料分为烤烟、晒晾烟和黄花烟3个群体。结果表明：（1）从960对引物组合中筛选出45对扩增带型清晰、重复性和多态性好的引物用于78份烟草种质资源遗传多样性研究,共检测到108个位点,其中96个位点具有多态性,多态性比例为88.89%。遗传多样性指数（Nei’s）为0.3766,Shannon’s指数为0.5821,种质间遗传相似系数变异范围在0.0454～0.9973之间,说明我国抗PVY烟草种质资源存在着丰富的遗传变异。（2）3个群体内遗传差异由大到小分别为：晒晾烟〉黄花烟〉烤烟。3个群体间遗传距离比较分析,晒晾烟与烤烟的遗传相似度达到0.9840。（3）聚类分析可将78份种质材料划分为黄花烟草和普通烟草2大类群,烤烟、晒晾烟之间没有明确的界线。聚类分析结果也表明,黄花烟与其他群体的遗传距离较远。