烟草青枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及生防特性研究

烟草青枯病危害严重, 以拮抗菌进行防病的生物防治手段成为研究热点。从不同烟田分离纯化出238株细菌菌株, 首先经牙签接种初筛, 选取对青枯病菌抑制效果较好的菌株制备其抑菌物质的粗提物, 以牛津杯法复筛, 最终获得3株对烟草青枯病菌有明显抑制作用的拮抗细菌。全细胞脂肪酸、16S rDNA及gyrB基因测序等分析结果表明, 菌株H19、Y6为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）, 菌株H34为甲基营养型芽孢杆菌（B.methylotrophicus）。3株拮抗菌经CAS检测平板法和Salkowski比色法, 发现均具有产铁载体和吲哚-3-乙酸（IAA）的能力, 以菌株H19能力最强。温室促生试验结果表明, 3株拮抗菌能显著促进烟草株高、鲜重及干重等指标, 与对照相比, 平均增长率分别达到70%~115%、40%~49%和32%~42%。温室控病试验结果表明, 菌株H19、H34和Y6明显降低烟草青枯病的发病率, 防效达76.57%、60.98%和69.83%, 稍逊于农用链霉素处理的78.66%。

放线菌F8对烟草黑胫病的拮抗作用及其产酶活性

从山东五莲于里黑胫病烟田健康烟株根际土壤分离到一株拮抗放线菌,编号为F8。为了科学评价该菌株在烟草黑胫病生防中的应用潜力,测定了其抑菌活性、产酶活性及控病效果,并通过形态学及16S rDNA序列分析研究其分类地位。结果表明,该菌株对于供试的烟草黑胫病菌具有较强的抑制作用,经无菌滤液处理后的菌丝生长畸形且停滞;该菌株具有几丁质酶、纤维素酶及蛋白酶活性。温室盆栽试验的防治效果显示接种后30 d,F8发酵液对烟草黑胫病的防效为70.3%;根据菌株形态特征、培养特性、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为链霉菌属不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes subsp.streptozoticus)。

烟草根系分泌物对烟草疫霉菌的抑制作用

为明确烟草根系分泌物对烟草疫霉菌的影响,采用液相色谱-质谱联用仪(Liquid chromatograph-mass spectrometry,LC-MS)检测小黄金1025和革新3号根系中共有分泌物含量的变化。通过菌落生长、孢子囊形成、菌丝生长量明确含量差异较大的5种共有根系分泌物对烟草疫霉菌的抑制效果,并利用盆栽试验检测其对烟草黑胫病的防治效果。结果表明,共有根系分泌物中,含量差异较大的化合物为酒石酸、二硝托胺、茉莉酮、棕榈酸和油酸。在低浓度(100μg/mL)条件下,5种化合物对烟草疫霉菌均具有显著的抑制效果,且随浓度的增加其抑制效果增强。酒石酸对菌丝生长、孢子囊形成的抑制率分别为36.72%和50.16%,棕榈酸对菌丝生长量的抑制率为59.86%。酒石酸和棕榈酸对烟草黑胫病的防治效果分别为53.11%和52.70%。因此,烟草根系分泌物中存在抑制烟草疫霉菌生长的物质,且能够在一定程度上防治黑胫病的发生。

贵州烟草上一株PVY坏死株系全序列测定与分析

2007年从贵州省贵定烟区采集一株呈典型马铃薯Y病毒坏死株系(Potato virus Y vein necrosis strain,PVYN)的烟草病毒病样,经PVY鉴别寄主枸杞(Lycium barbarum L.)单斑分离纯化后,于枯斑三生烟(Samsun NN)株上保存,得到PVY分离物Guiding-3。以GenBank中已有的PVY全序列为基础,设计了3对PVY特异引物。通过总RNA提取、RT-PCR及序列测定,发现所测得的PVY分离物Guiding-3全长基因组序列(NCBI登录号为HM590405)包括9 699个碱基,整条序列仅包含一个由9 186个碱基组成的开放读码框(ORF),编码一条包含3 061个氨基酸的多聚蛋白。利用MEGA软件对所测得的PVY全序列与GenBank中已有的PVY全序列进行系统进化分析,发现Guiding-3分离物的序列与PVYN、PVYNTN、PVYN:O、PVYO、PVYNNP株系的一致性分别为98%、97%、94%、92%、85%,在已有的PVY株系中,Guiding-3分离物与PVYN株系具有较高的进化亲缘关系。另外,还对PVY的分子变异进行了初步讨论。

山东烟草白绢病病原鉴定及室内防治药剂筛选

在实验室对采自山东费县费城烟株根部的白色菌丝进行分离、纯化,编号为FBJ,对其致病性、形态特征观察、生物学特性及防治药剂筛选进行了初步研究。结果表明,FBJ对烟草具有致病性,经形态特征及18S rDNA序列分析,FBJ为半知菌亚门,丝孢纲,无孢目,小菌核属的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)能引起烟草白绢病。FBJ白绢病菌适合在偏碱性条件下生长;菌丝和菌核致死温度为50℃处理10 min;通过室内药剂筛选,70%代森锰锌可湿性粉剂对FBJ病菌菌丝生长和菌核萌发的抑制效果较好。

WRKY转录因子在烟草受CMV侵染和激素处理中的表达模式初步分析

WRKY转录因子在调控植物抵抗病原菌的侵染中发挥重要作用,但是,目前为止还没有WRKY转录因子在烟草抗CMV中调控机理的研究。本研究检测了感病品种‘K326’和抗病品种‘TT8’在接种CMV后其WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11的表达情况。结果显示,CMV侵染后‘TT8’中4个WRKY转录因子表达量均有大幅上升;而‘K326’中WRKY2、WRKY4和WRKY11的表达量与CMV侵染前无显著差异,WRKY1表达量则大幅下降。幼苗经外源激素(水杨酸、茉莉素、乙烯)处理后用RT-PCR检测,结果表明,‘K326’和‘TT8’中WRKY转录因子对外源激素的诱导响应比较复杂多样,但总体表现为在‘TT8’中WRKY1、WRKY2和WRKY4会受到乙烯和茉莉酸的诱导,但在‘K326’中转录因子的表达未受明显诱导。

崂山常见中药材提取物对烟草青枯病菌的抑制作用

以烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum为病原指示菌,从艾叶Artemisiae argyi等40种崂山常见中药材95%乙醇提取液中筛选对其具有明显抑制作用的活性物质。结果表明,32种(80%)药材提取物显示出不同程度的抑菌作用,其中公丁香Syzygium aromaticum提取物抑菌活性最强,其抑菌圈直径达19.53 mm。采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用法分析鉴定了公丁香提取物中12种化学组分,其中相对含量最高的丁香酚(40.43%)抑菌活性最强,抑菌圈直径达18.50 mm,处理6 h对病菌的抑制中质量浓度(EC50)值为0.0292 mg/m L。本研究表明崂山地区抑菌植物具有丰富的多样性,公丁香提取物中活性成分丁香酚具有防治烟草青枯病的良好应用潜力。

烟草抗番茄斑萎病毒基因筛选与生物信息学分析

通过同源克隆的方法在TSWV高感烟草品种NC89、TSWV耐病烟草品种中烟100中分别克隆出一个疑似抗番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的基因,分别命名为NtSw-5^(NC89)和NtSw-5^(zy100)。序列分析表明,NtSw-5^(NC89)长3819bp,包含1个完整的读码框,编码1273个氨基酸,理论等电点和相对分子质量分别为5.64和147529.5Da;NtSw-5^(zy100)长3165bp,包含1个完整的读码框,编码1054个氨基酸,理论等电点和相对分子质量分别为6.75和122032.9Da;NtSw-5^(NC89)和NtSw-5^(zy100)均不含信号肽,均无明显跨膜区,二者均含有大多数植物抗性蛋白所共有的CC-(NB-ARC)-LRR典型结构。系统进化树分析表明,NtSw-5^(NC89)与马铃薯假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3近源关系最近,NtSw-5^(zy100)与烟草假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3同型X2近源关系最近。该结果可为烟草番茄斑萎病毒抗性研究和烟草番茄斑萎病毒的防治提供理论基础。

四川省烟草白绢病病原菌的分离鉴定及其生物学特性

烟草白绢病是近年来在四川烟区发现的新病害,为明确其病原特征,进而有效防治该病害,在烟田采集了烟株根部菌丝,进行分离、纯化,并命名为B1。并进行了病原菌形态观察,18S rRNA鉴定及致病性测定。结果表明,B1为半知菌亚门,丝孢纲,无孢目,小菌核属的齐整小核菌Sclerotium rolfsii Sacc。生物学特性研究表明,白绢病菌B1菌丝和菌核致死温度为50℃处理10 min,且菌丝更适合在偏酸性条件下生长,最适pH为5.0。

新型杀菌剂丁吡吗啉对烟草黑胫病生物学特性的影响

通过测定丁吡吗啉对烟草黑胫病菌菌丝生长速率的抑制、产孢力的影响、继代培养菌的敏感性及菌丝生长量的抑制,探究丁吡吗啉对烟草黑胫病生物学特性的影响。试验结果表明丁吡吗啉对烟草黑胫病菌的菌丝生长速率抑制和产孢力影响EC_(50)为2.19和0.66 mg·L^(-1),菌丝生长量抑制EC_(50)为7.53 mg·L^(-1),继代培养结果表明烟草黑胫病对丁吡吗啉的抗性增长缓慢。

烟草根系分泌物成分的鉴定及其对烟草疫霉菌的影响

[目的]探究烟草根系分泌物不同成分对烟草疫霉菌的影响。[方法]利用液质联用法鉴定烟草革新3号根系分泌物的成分,采用生长速率法测定烟草根系分泌物的抑菌效应。[结果]相对含量较高的32种烟草根系分泌物中,有12种分泌物对烟草疫霉菌具有抑制作用,5种具有促生作用;在800μg/mL浓度处理下,酒石酸、水杨酸、2-呋喃甲酸和土木香内酯对烟草疫霉菌抑制率分别为92.87%、97.14%、91.33%和93.76%,以水杨酸的抑菌效果最佳,与对照相比,其EC50均小于500μg/mL,其中酒石酸的毒力最强,EC50为159.68μg/mL。[结论]酒石酸、水杨酸、2-呋喃甲酸和土木香内酯4种根系分泌物对烟草疫霉菌有较好的生防效应。

一种根系分泌物收集装置的研制及在烟草分析中的应用

针对根系分泌物收集存在的问题,研制了一种不扰动根系生长、不破坏根际环境的收集装置。利用此装置收集感染/未感染烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)的烟草根系分泌物,采用液相色谱-质谱联用仪(Liquid chromatograph-mass spectrometry,LC-MS)检测获得的根系分泌物,通过PLS-DA和OPLS-DA分析根系分泌物有机物的变化,获得差异性代谢物主要为有机酸、碱、烯、醇、酯、酮、醛、酰胺等物质。在感染疫霉菌后,代谢物含量发生较大变化,其中差异性显著的物质有17种。为研究根系分泌物与疫霉菌互作识别提供重要的理论依据。

一种利用水提物快速简便检测烟草中TMV的方法

由烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染所致的植物病毒病是世界性的难题,具有寄主广泛,易于传播等特点。笔者研究了一种快速简捷检测烟草中TMV的方法,通过利用无菌水研磨TMV侵染后发病的烟草病叶,取上清液进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,可检测到一条特异性的,大小为6 000 bp的电泳条带,而在健康烟草叶片水提物中却检测不到该电泳条带的存在。以TMV复制酶基因片段为探针,对该特异性电泳条带进行Northern-blotting分析。结果表明,水提物中的电泳条带与TMV复制酶基因探针发生较强的杂交信号,暗示该条带可能为TMV的基因组。因此,该方法可在10 min内方便快速的检测烟株中TMV的存在,避免了常规血清学检测和分子检测(RT-PCR和western-blot)等方法的昂贵试剂和繁琐的操作步骤。但是该方法的水提取物在室温下不稳定,当静止3 h以上,就很难再检测到特异性的电泳条带。

酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响

为探究酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响,在混合青枯菌的不同酸碱度土壤中测定烟草青枯病的发病情况。应用qRT-PCR方法测定不同酸碱度条件下烟草青枯菌的消长动态,通过结晶紫法和半固体培养基法分别测定青枯菌的生物膜和运动性在不同酸碱度条件下的变化。结果表明:烟草青枯病在弱酸性和中性(pH 6.0~7.0)土壤中发病严重。烟草青枯菌的消长动态结果显示,青枯菌数量在pH 6.5的土壤中最多,为9.1×108cfu·g^(-1) FW。烟草青枯菌生物膜成膜能力在pH 5.5时最强,pH 7.0时最弱。pH6.5时烟草青枯菌的运动性最强,pH 8.0时最弱。土壤酸碱度通过影响青枯病菌的消长、成膜能力和运动性进而影响烟草青枯菌对烟株的侵染。

40种中药材提取物对烟草黑胫病菌的抑制作用

测定了崂山40种常见中药材提取液对烟草黑胫病菌的抑菌活性。结果表明,10 g/L乙醇提取物浓度下,有11种植物(占27.5%)提取物对烟草黑胫病菌抑制率达100%,有28种(占70%)抑菌率达80%以上。对公丁香提取液相对含量较高的4种组分的抑菌效果进行了进一步测定,结果表明,丁香酚和乙酸丁香酚酯10倍稀释液对黑胫病菌抑制率高,分别为100%和60.19%,说明丁香酚和乙酸丁香酚酯为公丁香的主要抑菌活性成分。本研究表明,公丁香提取物中活性成分丁香酚具有防治烟草黑胫病的良好应用潜力。

响应面法优化诺尔斯链霉菌发酵条件以提高谷氏菌素产量

诺尔斯链霉菌Streptomyces noursei的次级代谢产物丰富,抑菌谱广,在农业上具有潜在的应用前景。作者实验室筛选到一株诺尔斯链霉菌S. noursei NK27,其次级代谢产物对番茄灰霉病的防治效果显著。为了提高NK27次级代谢产物中谷氏菌素的产量,以NK27发酵液中谷氏菌素产量为响应值,采用单因素试验、Plackett-Burman (PB)试验、最陡爬坡试验以及响应面法中的Box-Behnken试验设计,对NK27的发酵条件进行了优化。结果表明,诺尔斯链霉菌种龄、接种量及初始pH值3个因素对发酵效果影响最为显著。优化后的发酵条件为:初始pH值7.6,种龄32.6 h,接种量2.6%,转速220 r/min,发酵时间144 h。与原始发酵条件相比,优化后谷氏菌素含量提高了约3倍。本研究可为诺尔斯链霉菌大规模工业化发酵提供理论依据和技术支撑。

黏质沙雷氏菌次生代谢物对TMV的抑制机理

【目的】分离、纯化和鉴定黏质沙雷氏菌2A2次生代谢物中具有抑制TMV侵染力的活性成分,明确其对TMV的抑制机理。【方法】通过病毒生物学测定,确定黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV的抑制效率。为明确黏质沙雷氏菌2A2发酵液次生代谢物中抑制TMV侵染力的活性成分,通过TLC和硅胶柱层析对其发酵液进行了分离纯化,获得主要的次生代谢物,通过局部枯斑法测定各代谢物的生物学活性,筛选可显著抑制TMV侵染活性的物质,经NMR分析,确定其成分结构,进而确定物质组分。为进一步揭示代谢物对TMV的抑制机理,利用透射电子显微镜探索代谢物对TMV粒体形态的影响,TMV粒体与代谢物甲醇溶液混合30 min后,于透射电子显微镜下观察TMV粒体形态。同时,用代谢物甲醇溶液喷施处理寄主下部3片叶,共设5个处理:处理Ⅰ,喷施代谢物24 h后,接种TMV;处理Ⅱ,代谢物与等体积TMV汁液混合30 min后,接种叶片;处理Ⅲ,先接种TMV,24 h后喷施代谢物;处理Ⅳ,宁南霉素(50μL·mL-1)与等体积TMV汁液混合30 min后,接种下部叶3片做阳性对照;处理Ⅴ,无菌水与等体积TMV汁液混合30 min后,接种下部叶3片做空白对照。分别在次生代谢物诱导和TMV侵染后1、3、5、7、9 d,取未经任何处理的上部叶,TRIZOL法快速提取总RNA并反转录cDNA,利用real-time RT-PCR分析样品PR基因和TMV的RNA相对表达量,进而明确代谢物处理寄主对寄主PR基因表达的影响和对TMV在寄主体内复制增殖的抑制作用。【结果】黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV具有显著的抑制作用。对其发酵液进行分离纯化,获得3种主要代谢物,通过局部枯斑法测定,编号为BJH-2的代谢物可显著抑制TMV的侵染活性,经NMR分析,确定了该代谢物为灵菌红素(prodigiosin)。透射电子显微镜结果显示灵菌红素可显著破坏TMV粒体,使TMV典型的杆状病毒粒体降解断裂成排列紊乱的短杆状。real-time RT-PCR结果表明,灵菌红素处理植株后,处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ可诱导寄主体内PR基因表达随着时间逐渐上调,第7天左右,三者处理的寄主体内PR1、PR2、PR4、PR5表达上调至高峰,显著高于空白对照,亦高于处理Ⅳ的阳性对照,从而提高系统抗性;灵菌红素处理植株后,处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ寄主体内TMV RNA的表达量随着时间上调减缓,在接种TMV后的第9天,三者处理的寄主体内的TMV RNA含量分别是空白对照的11.98%、5.23%、15.90%,显著低于空白对照,亦低于处理Ⅳ的阳性对照。【结论】灵菌红素既对TMV在寄主体内的复制增殖具有抑制作用,又可诱导寄主产生系统抗性,整体效果高于宁南霉素,可作为防治植物病毒新的生物制剂。

烤烟青枯病田间发生动态及其与气象因素的相关性

2013—2014年对南平建阳烟田土壤青枯病菌数量和发病情况进行了系统调查,分析了病害与主要气象因子的相关性。结果表明,SMSA半选择性培养分离法和荧光定量PCR法均能有效检测土壤中青枯病菌,前者检测的青枯病菌数量与病情指数相关性(R^2=0.8191)高于后者(R^2=0.7464)。空气温度、湿度、降水和日照时数等气象因子中,温度是影响南平烟田青枯病菌数量和发病程度的关键气象因子。5月下旬至6月初,周平均温度高于22℃时,病害进入始发期,此时根际土壤中病菌数量高于5.0×10~5 cfu/mL。6月上旬至中旬,周平均温度在22~25℃,病害处于平稳发展期,青枯病菌数量在1.0×10~5~2.2×10~6 cfu/g。6月中下旬,周平均气温高于25℃,病害进入爆发期,青枯病菌数量在2.2×10~6 cfu/g以上。温度对于指导青枯病的预测预报和防治具有重要价值。

烟蚜茧蜂触角的超微结构与冷藏对触角的影响

【目的】明确烟蚜茧蜂(Aphidius gifuensis)触角和触角感觉器的外部形态及低温冷藏对其触角的影响,为烟蚜茧蜂的有效利用提供依据。【方法】采用扫描电镜观察正常羽化的烟蚜茧蜂雌、雄蜂触角的超微结构,比较雌、雄蜂触角感觉器的差异。将处于老熟幼虫期的烟蚜茧蜂在4℃低温下分别冷藏7、14、21和28 d,冷藏后用乙醇对样品进行脱水处理,并在扫描电镜下观察低温冷藏对烟蚜茧蜂触角外部形态及触角感觉器的影响。【结果】烟蚜茧蜂雌、雄成蜂触角外部形态相似,均属于丝状触角。雄蜂触角平均长度略长于雌蜂,雌蜂触角多为17节,雄蜂触角多为19节。成蜂触角上共有6种类型的感觉器:毛形感觉器、刺形感觉器、板形感觉器、B?hm氏鬃毛、腔锥形乳突状感觉器和锥形感觉器。毛形感觉器I主要分布在触角鞭节上,是触角上分布最广、数量最多的感觉器。板形感器主要分部在鞭节上,雄蜂从第1鞭节开始出现,雌蜂从第2鞭节开始出现。腔锥形乳突状感觉器II只存在于雄蜂触角上。雌、雄蜂感觉器的数量存在差异,雌蜂的刺形感觉器I数量多于雄蜂,雄蜂的刺形感觉器II和板形感觉器的数量则多于雌蜂。低温处理14、21、28 d后,板形感觉器、腔锥形乳突状感觉器均表现畸形,且触角最后两节分节不明显,有愈合成一节的趋势。冷藏28 d后,54%雄性触角不能正常分节,由正常情况下的19节而愈合为18节;69%的雌性触角不能正常分节,由正常情况下的17节而愈合为16节。【结论】烟蚜茧蜂触角属于丝状触角,共有6种类型感觉器。雄蜂触角长于雌蜂,感觉器的分布特点相似。低温冷藏对烟蚜茧蜂某些触角感觉器形态及触角末两节分节有显著影响。为减少冷藏对烟蚜茧蜂的伤害,应尽量避免在蛹期以前的虫态低温保存蜂种,且应缩短冷藏时间。

仓储片烟霉变的影响因素分析

利用单因素与正交试验相结合的方法,研究了环境温度、湿度和片烟含水率对片烟霉变的影响。结果表明,环境湿度和片烟含水率是影响片烟霉变的关键因素。空气相对湿度70%,且片烟含水率15%以下,片烟未发生霉变。在环境湿度75%～80%,片烟含水率低于19%,片烟易发生轻度霉变。环境湿度高于80%,或空气相对湿度75%,片烟含水率高于19%时,片烟极易发生霉变。