海南产大尉芋螺的新型O-超家族芋螺毒素基因克隆

目的从海南产大尉芋螺毒液中分离克隆新型O-超家族芋螺毒素基因,为大尉芋螺毒素药物的研究与开发提供源头化合物。方法采用快速扩增cDNA 3’-末端(3’-RACE,Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法,对我国海南产大尉芋螺(Conus capitaneus Linnaeus)的毒素cDNA进行分析,克隆测序所得基因片段,再进行序列比较,以及O-超家族芋螺毒素基因的遗传变异分析。结果发现了1种新的O-超家族芋螺毒素cDNA序列CaHr91N,编码长度为77个氨基酸(aa)的前体蛋白CaHr91P,具有典型的芋螺毒素前体结构特征,即由21aa的信号肽、22aa的前肽与34aa的成熟肽三部分组成。毒素区的成熟肽CaHr91M序列为ECREQSQGCTNTSPPCCSGLRCSGQSQGGVCISN,具有O-超家族芋螺毒素保守的半胱氨酸框架C-C-CC-C-C.同时比较分析了CaHr91P与其它同源性的O-超家族芋螺毒素的相似性,以及大尉芋螺毒素的研究状况。结论CaHr91P新芋螺毒素基因的发现,及其序列的阐明,为进一步研究其生物活性和应用奠定了基础,同时为更多大尉芋螺毒素的发现和研究利用积累了经验。

海洋药物特色的药物分析课程教学改革与实践

药物分析课程是药学专业的主干课程,在药学研究与开发中占有重要的地位。为了适应高等学校特色专业人才培养的要求,结合海南地区海洋药物资源丰富的优势,从而开展以海洋药物为特色的药物分析课程改革与实践。优化教学内容,提升学生对海洋药物的认知,掌握常用海洋药物的分析方法,等成为本课程教育改革的重要内容。

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。

毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化

随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的60％-70％。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。

海葵神经毒素研究进展

过去30多年的研究表明,海葵毒液中富含多肽或蛋白类生物毒素活性物质,分子量从3000到80000Da不等。这些毒素可以特异地与某些离子通道或细胞膜受体相结合,从而影响生物的某些生理功能。按照它们功能的不同,可以将海葵毒素大致分为两大类:神经毒素和溶细胞素。由于海葵神经毒素对它们的作用位点具有高度的特异性和亲和性,使得它们成为神经生理学和药理学研究的一种重要工具。就海葵毒素的类型、结构特征、生物活性、应用状况及开发前景的新进展进行综述,以期对同类研究些微启迪。

cDNA文库在药用海洋生物研究中的应用

cDNA文库技术在基因分离和克隆中具有重要作用并得到广泛应用。现概述cDNA文库技术及其在药用海洋生物中的应用,并对我国药用海洋生物开发前景作了展望。

水母毒素研究进展

水母毒素是一类结构独特而新颖的蛋白质,是一大类潜在的海洋药物先导化合物。该文概述了水母及其毒素的基本特征,详细阐述了水母毒素的结构特征、生理效应和生物活性,为以后研究水母毒素的生物活性和药理作用奠定基础,为充分利用其有效成份,开发新型的海洋生物药物提供更多的线索。

抗菌肽Brevinin-GR23抗金黄色葡萄球菌作用机制的初步研究

Brevinin-2GHe是从海南沼蛙(Hylarana guentheri)皮肤中获得的抗菌肽,为进一步优化该抗菌肽和分析其结构与生物学活性之间的关系,本研究去除了Brevinin-2GHe的7个C-末端氨基酸,并通过固相合成获得了含有23个氨基酸的brevinin-GR23;同时,检测了抗菌肽brevinin-GR23的抗菌活性和最低抑制浓度以及brevinin-GR23的时间杀菌曲线;判断了brevinin-GR23对细菌细胞膜完整性的影响;分析了brevinin-GR23对细菌体内DNA的作用;测定了其对兔红细胞的毒性作用;检测了brevinin-GR23在不同溶液环境中的二级结构,并通过在线软件分析了其3D结构.结果表明:抗菌肽brevinin-GR23对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌活性最好,最低抑制浓度为16. 6μmol/L;在120 min时,其抑制细菌的效率最高,但对兔红细胞的溶血活性却较低.核酸泄露的实验结果显示,brevinin-GR23不仅能增加S. aureus的细胞膜渗透性,而且它还能与细菌DNA结合,干扰金黄色葡萄球菌DNA的复制,从而发挥抑菌作用.二级结构分析表明:brevinin-GR23在PBS溶液中以不规则结构为主,而在膜模拟溶液中其却能转变成α螺旋结构,这有利于其与细菌细胞膜的结合,因而致使细菌细胞膜的完整性发生了改变.在线软件的分析显示:其3D结构为α螺旋,经改造后的brevinin-GR23,其分子量更小,且活性强、毒性小、化学合成成本较低,这更有利于进一步的开发与应用.

池塘封闭循环水养殖废水脱氮的试验研究

确定封闭循环水养殖池塘系统对养殖水体的脱氮能力。循环净水系统主要有生物合成固氮、污泥吸附分离脱氮、光化学脱氮、微生物脱氮、物理脱氮等环节，采用海洋监测国家标准方法对系统中的南美白对虾（Penaeus vannamei）养殖水体进行跟踪监测。结果表明：系统对养殖水体中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和氨氮的去除率分别为10．37％-27．35％、22．45％-44．74％和22．00％-79．53％，脱氮解毒效果较好。

泰国产方斑东风螺养殖群体遗传多样性的RAPD分析

用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对泰国产方斑东风螺养殖群体的遗传多样性进行检测,从100个随机引物中筛选出21个引物对方斑东风螺的DNA进行扩增,结果表明：21个引物共检测到222条清晰且重复性好的条带,每个引物可扩增出4～16条带,分子量在200～2200bp之间,其中多态位点为156个,占70.27%;群体的Shannon多样性指数为0.2818,Nei基因多样性指数为0.2491;个体间最大遗传距离为0.291,最小遗传距离为0.066。通过与其他贝类遗传多样性的研究结果比较,可初步判断泰国产方斑东风螺养殖群体的遗传多样性比较丰富。

马氏珠母贝(Pinctada martensii)2个不同地理种群遗传变异的EST-SSR分析

应用17个EST-SSR位点分析表明,马氏珠母贝印度种群和三亚种群的平均FST值为0.486,两个种群的分化程度高;三亚种群的等位基因数为1—6,有效等位基因数为1.0—3.3;印度种群的等位基因数为2—7,有效等位基因数为1.1—3.3;三亚种群和印度种群的平均有效等位基因数分别是1.8和1.9;三亚种群和印度种群的等位基因丰度分别为3.16和3.39;印度种群无论是期望杂合度(HE)还是观察杂合度(HO)都高于三亚种群,印度种群的期望杂合度和观察杂合度分别是0.42和0.16;三亚种群的期望杂合度和观察杂合度分别是0.38和0.15;三亚种群与印度种群的Nei’s遗传距离为1.119。两个种群都保持了中等水平遗传多样性。由于两个种群高度的遗传分化和保持丰富的遗传多样性为开展两个种群间杂交及获得杂种优势奠定了基础。

热应激对波纹唇鱼免疫功能的影响

为了研究波纹唇鱼对热应激效应的基因表达差异,本研究运用高通量RNA-seq技术在热应激和常温条件下,对波纹唇鱼的基因进行了转录组测序. DEGs鉴定结果表明:1655个基因受热应激诱导后差异表达;GO富集分析显示:表达上调的基因包括MCM、DNA复制起始等与细胞组成和生物过程相关的基因;而表达下调的基因主要集中于ERK等与机体免疫应答相关的因子;实验结果表明:热应激会导致波纹唇鱼免疫应答相关基因的下调,也可能会导致其免疫应答功能的下降.波纹唇鱼在热应激条件下的免疫功能下降可能是导致其死亡的原因,这为波纹唇鱼资源保护和人工养殖技术提供了理论支持.

雌核发育棕点石斑鱼EST-SSR的开发验证

通过人工雌核发育棕点石斑鱼( Epinephelus fuscogutatus)的转录组序列,共获得了24 359 个微卫星位点,棕点石斑鱼转录组的微卫星重复基序具有不同的分布特征,其中以单碱基( 34. 05 %)、二碱基( 37. 58%)和三碱基( 22. 75 %)为主要的EST-SSR基序重复类型.根据微卫星引物设计原则,随机筛选了93 个EST-SSR位点来进行引物合成和多态性检测,最终开发了48 个具有多态性的微卫星标记,并在不同棕点石斑鱼群体中进行了初步的验证.结果显示:每个位点等位基因数( Na)为2 ~ 22,平均等位基因数为9;观测杂合度( Ho)为0. 111 ~ 1. 000,期望杂合度( He)为0. 636 ~ 0. 940;多态信息含量( PIC)为0. 538 ~ 0. 922 个,表明48 个EST-SSR位点均表现出高多态性( PIC > 0. 5).结果表明:基于雌核发育棕点石斑鱼转录组数据,开发微卫星标记是可行的.本研究所开发的具有多态性的微卫星标记可应用于棕点石斑鱼及其近缘种的遗传多样性分析和分子标记辅助育种研究.

卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础.

含多巴环二肽cyclo(DOPA-Ala)和cyclo(DOPA-Gly)的合成及其抗菌活性

含左旋多巴(L-DOPA)环二肽的制备,通常采用在高沸点醇中回流的方式来促使相应直链二肽进行环化反应.本文设计发展了一种新的合成方案,包括:采用缩丙酮保护L-DOPA的侧链儿茶酚羟基;偶合L-DOPA与氨基酸Gly或Ala的衍生物制备直链二肽甲酯;于室温下、在哌啶催化下,进行环化反应并制得保护状态的环二肽;在三氟乙酸的作用下去除保护基而得到目标环二肽cyclo(DOPA-Gly)和Cyclo(DOPAAla)(纯度高,总收率良好).抗菌实验表明:此两种含多巴环二肽对大肠杆菌和金色葡萄球菌基本不具有抗菌活性;相反,它们可以微弱地促进实验细菌在含有低浓度乙酸/DMSO的培养基中生长.

虾青素通过线粒体抑制高糖诱导的HBZY-1细胞凋亡

为了探究虾青素是否能有效改善高糖诱导的HBZY-1细胞的凋亡及其抗凋亡的机制,本研究采用CCK8法测定了正常糖和高糖环境下,不同浓度的虾青素对HBZY-1细胞活力的影响,并运用相关试剂盒测试了细胞死活比例和细胞凋亡的变化,在光镜下观察了HBZY-1细胞形态的变化,使用JC-1探针在荧光显微镜下观察了HBZY-1细胞线粒体膜电位的变化,运用Western Blot技术检测了HBZY-1细胞中促细胞凋亡蛋白bax和抑制细胞凋亡蛋白bcl-2的表达水平,运用caspase 3/7活细胞荧光实时法检测了HBZY-1细胞中的caspase 3/7活性.结果表明:虾青素可有效逆转高糖引起的细胞活力降低,能抑制高糖引起的HBZY-1细胞凋亡和细胞形态异常,并能改善线粒体膜电位和影响参与调控HBZY-1细胞的凋亡相关蛋白.由此认为:虾青素可以通过影响线粒体膜电位来改善高糖引起的肾小球系膜细胞凋亡,其有可能成为改善糖尿病肾病的潜在药物.

基于磁化原位离子液体分散液液微萃取测定天然椰子水中菊酯农药的含量

本研究建立了新型的超声辅助-Fe_3O_4磁性纳米粒子磁化-原位离子液体分散液液微萃取(UA-MISDLLME)法并结合高效液相色谱测定了天然椰子水中三种拟除虫菊酯农药的残留量.研究显示:萃取效率的影响因素包括离子液体的种类、离子液体的体积、离子交换剂的体积、Fe_3O_4磁性纳米粒子的用量、洗脱剂的种类以及超声时间等;三种拟除虫菊酯农药在0. 5～50 mg L^(-1)范围内呈现出良好的线性关系,相关系数为0. 999 4～0. 999 9,加标回收率为84. 8%～100. 6%,检测限为0. 034～0. 053 mg·L^(-1).结果表明,本方法适合于天然椰子水中三种菊酯农药残留量的检测,该方法中的超声辅助以及磁化原位交换反应简化和加快了样品前处理过程,并且绿色溶剂-离子液体种类的选择范围被进一步拓宽.

天然产物中齐墩果酸和熊果酸提取和分析方法研究进展

对不同天然产物中熊果酸和齐墩果酸的提取纯化方法及分析方法进行综述,并比较了各方法的优缺点。

褐藻素对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞纤维化病变的缓解作用

为了探讨褐藻素(fucoxanthin,FX)是否对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的纤维化病变有缓解作用,同时也为了探究其作用机制,本研究通过Western Blot方法,检测了细胞外基质的主要成分—纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和四型胶原(collagen IV,Col IV)的表达;利用免疫荧光方法观察了细胞中FN的含量;采用罗丹明标记鬼笔环肽对细胞骨架进行染色,观察了细胞骨架的变化;使用相关试剂盒检测了细胞内活性氧的变化、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的酶活性以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;利用Western blot方法观察了细胞炎症相关因子ICAM-1和TGF-β1的表达.结果表明:在高糖刺激下的肾小球系膜细胞中蛋白FN和Col IV的含量显著升高,细胞呈现肥大状态;FX的处理在一定程度上可缓解上述病理现象,FX处理后高糖诱导升高的活性氧和MDA含量显著降低,而高糖诱导的下调的SOD活性被显著升高;高糖下显著升高的炎症因子—细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的蛋白水平同样被FX逆转.由此认为:FX可以减少高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的细胞外基质成分的积累,而且可以缓解细胞肥大现象,其机制可能与细胞内氧化应激减轻和炎症因子表达减少有关.研究提示:褐藻素对糖尿病肾病具有一定的保护效应.