细菌脂蛋白耐受中核转录因子核转位机制研究

目的探讨细菌脂蛋白（BLP）耐受所致核转录因子-κB（NF-κB）活化受抑制的分子机制。方法以不同浓度BLP（10、100、1000ng／m1）预处理人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）诱导BLP耐受，再以不同浓度BLP（O、10、100、1000ng／m1）刺激经BLP预处理（耐受组）或未经BLP预处理（对照组）的THP-1细胞，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的释放，确定最适的BLP预处理和刺激浓度。然后按此条件处理细胞不同时间（O、0．5、1、2、6h）并提取蛋白，用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测NF-κB亚单位p50和p65的表达、核转位及磷酸化情况。结果对照组中10、100、1000ng／mlBLP可剂量依赖性刺激THP1活化并产生TNF-α（pg／ml：184．86±32．51、3215．88±167．09、6042．96±245．37），耐受组中100ng／mlBLP预处理几乎完全抑制不同剂量BLP诱导的TNF-α释放。故最适BLP预处理浓度为100ng／ml，刺激浓度为1000ng／ml。Western blotting检测表明，在BLP耐受的细胞质中p50蛋白表达明显高于对照组（0h：542．9±15．6比272．8±13．2，0．5h：558．0±16．9比236．4±11．8，1h：524．7±17．5比211．6±9．8，2h：584．9±15．6比222．4±12．3，均P〈0．01），而两组间P65蛋白无明显差异。BLP刺激还可诱导对照组细胞中p50和p65发生核转位，即细胞核中p50和p65蛋白增加（1hp50：344．2±13．6比79．0±5．2，p65：78．4±4．5比0，均P〈0．05），而耐受组细胞核中p50和p65均无明显变化。另外，BLP刺激还可诱导对照组细胞中p65的536位丝氨酸发生快速磷酸化（O．5h：0．67±0．08比0．04±0．01，1h：0．71±0．11比0．04±0．01，均P〈0．05），但是在BLP刺激的耐受组细胞中磷酸化p65蛋白水平无明显变化。结论BLP耐受的THP-1细胞中抑制性NF-κB亚单位p50表达上调，而具有转活化能力的亚单位p65的核转位及磷酸化均受到抑制，可能是BLP耐受中TNF-α等NF-κB依赖的基因表达减少的分子机制之一。

白细胞介素-1受体相关激酶1蛋白过表达对细菌脂蛋白耐受的影响

目的探讨细菌脂蛋白（BLP）信号转导分子Toll样受体2（TLR2）和白细胞介素-1受体相关激酶1（IRAK-1）与BLP耐受发生的关系。方法在人胚肾293（HEK293）细胞中过表达TLR2以及IRAK-1蛋白，利用蛋白质免疫印迹法和双荧光素酶报告基因检测实验观察其对BLP耐受的影响。结果以BLP刺激稳定转染并表达TLR2的HEK293细胞可以剂量依赖性地诱导NF—xB活化，而且BLP预处理HEK—TLR2细胞可诱导BI，P耐受的发生。在HEK—TLR2细胞中过表达IRAK-1可以剂量依赖性地增加NF—KB的活化并逆转BLP耐受：转染前BLP活化组与耐受组的NF—κB活化程度分别为0．3294±0．010和0．168±0．010；转染0．02／μgIRAK-1质粒后活化组与耐受组的NF—κB活化程度分别为0．493±0．010和0．427±0．035，均比转染前明显升高，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论HEK293细胞中过表达TLR2不能阻止BLP耐受的诱导，但是在HEK—TLR2细胞中过表达IRAK-1可部分逆转BLP耐受，提示IRAK-1蛋白表达水平的变化在BLP耐受发生中起关键作用；IRAK-1可作为细菌感染和脓毒症治疗的重要靶点。